豬溶菌酶的重組表達(dá)及其增效研究.docx

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1、豬溶菌酶的重組表達(dá)及其增效研究隨著食品安全問題的日益突出以及飼用抗生素濫用問題的愈發(fā)嚴(yán)重,尋找安全無污染、高效穩(wěn)定、廣譜抗菌且能夠規(guī)模生產(chǎn)的抗生素替代品已經(jīng)迫在眉睫。作為動(dòng)物機(jī)體免疫系統(tǒng)的組成部分,溶菌酶是天然的抗生素替代品,目前已被普遍應(yīng)用在醫(yī)藥、生物科研、食品以及飼料等領(lǐng)域,前景非常廣闊。然而,作為畜牧行業(yè)最重要的成員之一,豬還沒有專用的溶菌酶產(chǎn)品。豬溶菌酶(Susscrofalysozyme,SSL)作為豬體內(nèi)抵抗細(xì)菌性疾病的重要屏障,不僅具備傳統(tǒng)C型溶菌酶的抗菌功能,還能抵抗胃蛋白酶的降解作用,是最理想的豬用抗生素替代品。

2、然而,由于SSL的來源有限(主要通過豬胃組織的提取),加之其抗革蘭氏陰性菌的能力較差,目前還沒其相關(guān)應(yīng)用的報(bào)道。本文利用基因工程的手段,通過微生物發(fā)酵的方法規(guī)?；a(chǎn)SSL產(chǎn)品;同時(shí)利用胰蛋白酶對SSL水解結(jié)合一定的分離純化技術(shù),獲得了可以殺滅革蘭氏陰性菌的抗菌肽產(chǎn)品;然后利用基因修飾的方法,將SSL中抗菌肽的作用強(qiáng)化,得到了既保留SSL抗革蘭氏陽性菌的性能,又可以殺滅革蘭氏陰性菌的新型SSL產(chǎn)品。此外,還對新型SSL產(chǎn)品的抗菌機(jī)理進(jìn)行了探究,為其工業(yè)化應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。(1)根據(jù)NCBI網(wǎng)站的基因序列,化學(xué)合成了SSL的編碼基因

3、,并對其進(jìn)行大腸桿菌宿主的密碼子優(yōu)化,在BL21(DE3)中成功得到了誘導(dǎo)表達(dá)。在最優(yōu)的誘導(dǎo)條件(25℃,前培養(yǎng)時(shí)間3h,利用0.8mmol·L-1的IPTG誘導(dǎo)8h)發(fā)酵后,通過對包涵體的洗滌、溶解、透析以及濃縮,最終獲得了166.91±3.37mg·L-1的SSL,比酶活力可達(dá)7950.42±226.67U·mg-1。利用畢赤酵母X-33(pPICZαA)成功地表達(dá)了SSL基因,并比較了兩種密碼子的優(yōu)化方法對SSL基因在畢赤酵母中表達(dá)的影響,發(fā)現(xiàn)“全局隨機(jī)優(yōu)化法”對其表達(dá)量的提高較為明顯,最終獲得了189.28±4.16mg·

4、L-1比酶活力為2845.38±124.19U·mg-1的SSL產(chǎn)品,總蛋白表達(dá)量是原始基因表達(dá)量的2.63倍,而“一對一”優(yōu)化法對其表達(dá)無明顯改善。此外,組成型表達(dá)載體pGAPZαA和蛋白酶缺陷型宿主SMD1168H均無法達(dá)到野生型(誘導(dǎo)表達(dá)載體)X-33(pPICZαA)的表達(dá)水平。通過親和層析或SSL的復(fù)性過程,結(jié)合超濾的純化方法,得到了電泳純的SSL產(chǎn)品。對其酶學(xué)性質(zhì)和抗菌特性進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)重組SSL的性質(zhì)與其理論值基本一致:最適反應(yīng)溫度35℃、最適反應(yīng)pH6.0,說明利用微生物發(fā)酵的方法生產(chǎn)SSL是切實(shí)可行的。而通過對

5、大腸桿菌和畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)SSL的過程進(jìn)行比較分析,發(fā)現(xiàn)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的生產(chǎn)周期更短,得到的產(chǎn)品比酶活力更高,有助于對其性質(zhì)開展進(jìn)一步研究。(2)通過對SSL進(jìn)行蛋白酶水解,產(chǎn)物的SDS-PAGE分析以及抗菌活性測定,發(fā)現(xiàn)SSL對胃蛋白酶的水解具有抗性;而胰蛋白酶的水解物具有最強(qiáng)的抗革蘭氏陰性菌活性,其抗菌系數(shù)可達(dá)2.81,可殺滅99%以上的測試菌。利用凝膠過濾色譜和反相分離色譜的分離純化,結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用的分離與鑒定,得到了兩種對革蘭氏陰性菌具有抗菌活性的肽,其氨基酸序列分別為:G-V-S-L-A-N-W-V-C-L-A-K(

6、LP)和A-W-V-A-W-K(SP)。經(jīng)化學(xué)合成以后進(jìn)行抗菌譜的測定,發(fā)現(xiàn)LP對革蘭氏陰性菌具有抗菌活性,但是對革蘭氏陽性菌卻沒有相應(yīng)的作用;而SP既可以殺滅革蘭氏陰性菌,也基本上保留了SSL的抗革蘭氏陽性菌的能力。通過圓二色譜(Circulardichroism,CD)分析,Swiss-modeling結(jié)構(gòu)模擬以及AFM檢測,推測LP和SP的作用方式與具備螺旋-回環(huán)-螺旋(Helix-loop-helix,HLH)結(jié)構(gòu)域的抗菌肽類似:主要是通過改變靶細(xì)胞細(xì)胞膜的通透性來殺死細(xì)胞。但是它們作用的具體方式不同,LP可能是通過地毯式

7、模型的作用方式,而SP則是可能借助于其α-螺旋結(jié)構(gòu)在細(xì)胞膜上形成孔洞。(3)將本研究中分離得到的抗菌效果較好的抗菌肽SP的編碼基因、含有SP的HLH的編碼基因以及SP的六拷貝的6SP編碼基因分別與SSL的編碼序列的N端或C端進(jìn)行融合,構(gòu)建表達(dá)載體后發(fā)酵得到了既能保留SSL殺滅革蘭氏陽性菌的能力,又具備SP的抗革蘭氏陰性菌活性的新型溶菌酶產(chǎn)品。同等條件下,SSL的N端融合產(chǎn)物的抗菌活性要明顯高于C端的融合產(chǎn)物。通過CD與Swiss-modeling分析發(fā)現(xiàn),融合SSL的N端距離SSL的活性中心更近,可能與其作時(shí)用的底物結(jié)合有關(guān)。其中

8、,N端融合產(chǎn)物6SP-SSL的抗菌活性最高。6SP的存在一方面提高了SP與靶細(xì)胞的接觸幾率,另一方面也提高了融合產(chǎn)物的疏水性,增加了其與靶細(xì)胞的結(jié)合能力。此外,SSL與SP的協(xié)同作用也有所體現(xiàn),特別是作用于金黃色葡萄球菌Staphylococcus