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《美洲型PRRSVGP4蛋白中和單抗的制備及其抗原表位鑒定.docx》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、美洲型PRRSVGP4蛋白中和單抗的制備及其抗原表位鑒定豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,PRRSV）是引起豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）的病原,我國發(fā)現(xiàn)的位于PRRSV5亞群的PRRSV類NADC30株自2013年以來廣泛流行。PRRSV的糖蛋白GP4在PRRSV感染以及產(chǎn)生中和抗體過程中發(fā)揮重要作用,但對于具有中和活性GP4MAb的制備與研究卻鮮有報道。本研究目的是制備具有中和活性的PRRSVGP4蛋白的單克隆抗體（MAb）并鑒定出MAb識別的抗原表位,對了解PRRSV基因組的結(jié)構(gòu)與功能,以及
2、進一步利用中和單抗對PRRS進行免疫防治具有非常重要的意義。本研究用純化的PRRSVSD53株病毒免疫6周齡的BALB/c雌鼠三次,第三次免疫7天后,經(jīng)IFA檢測結(jié)果顯示小鼠血清全部轉(zhuǎn)陽。取血清已經(jīng)轉(zhuǎn)為陽性的小鼠脾細胞和骨髓瘤SP2/0細胞進行細胞融合。經(jīng)四次亞克隆,并對所篩選雜交瘤細胞分泌出的抗體進行穩(wěn)定性驗證,結(jié)果表明成功獲得一株能夠穩(wěn)定分泌抗PRRSVMAb的陽性雜交瘤細胞株,命名為LM26;對所獲得的陽性雜交瘤細胞大量培養(yǎng),并以這株細胞制備腹水,收集制備的腹水,經(jīng)親和層析純化,westernblot分析結(jié)果表明,已經(jīng)獲得了純化后的MAb。IFA測定MAbLM26的細胞培養(yǎng)
3、上清及腹水的效價為1:16和1:1600。該MAb對北美洲型PRRSVSD53株具有中和活性,中和效價最低為1:6,最高為1:50。該MAb亞型為IgG2a亞類,輕鏈為κ鏈。本研究進一步明確了LM26為抗PRRSVGP4單抗,并精確鑒定其識別的抗原表位。首先,將PRRSVSD53株一系列結(jié)構(gòu)蛋白的核酸序列擴增后回收,利用兩個核酸內(nèi)切酶切開,并將回收后的片段連入到pGEX-6P-1表達的載體中,把一系列重組表達的質(zhì)粒構(gòu)建出來,利用這些質(zhì)粒,進行重組蛋白的誘導(dǎo)和表達,獲得了一系列表達的結(jié)構(gòu)蛋白短肽與GST的融合蛋白。westernblot結(jié)果顯示,一系列重組蛋白均成功表達,且LM26
4、僅與PRRSV重組表達后的GP4蛋白能夠特異性的結(jié)合。其次,將測序正確后的質(zhì)粒pCAGGS-FLAG-GP4瞬時轉(zhuǎn)染到293T細胞作為檢測抗原,用IFA驗證已經(jīng)成功表達的重組GP4蛋白與LM26反應(yīng),證明抗PRRSVGP4MAb已經(jīng)被成功的制備。最后,對該MAb識別GP4蛋白上抗原表位進行鑒定,westernblot結(jié)果顯示LM26識別GP4蛋白的aa57aa62(57VVLQDI62)。將序列57VVLQDI62與在GenBank中下載的28株國內(nèi)外PRRSV株GP4氨
5、基酸序列比對,結(jié)果顯示,位于GP4蛋白的aa57aa62這段序列,在HP-PRRSV株以及類NADC30PRRSV株中呈現(xiàn)高度保守;在經(jīng)典PRRSV株中存在2個突變位點,分別是V57A和Q60H;在歐洲PRRSV株中存在1個突變位點V57M。然而,IFA檢測結(jié)果顯示,LM26與疫苗株HuN4-F112、CH-1R、MLV、TJM-F92反應(yīng),與歐洲株DV、VP046BIS不反應(yīng),由此推測V57A、Q60H突變不影響LM26對抗原表位的識別,該表位在美
6、洲型PRRSV中相對保守。綜上所述,本研究成功制備出一株具有中和活性的抗PRRSVGP4蛋白MAb,并鑒定了其識別表位位于GP4蛋白57VVLQDI62,該MAb有助于進一步研究PRRSV基因組的結(jié)構(gòu)和功能。
