資源描述：
《網(wǎng)箱養(yǎng)殖患病草魚鑒別與感染.doc》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在應(yīng)用文檔-天天文庫。
1、學(xué)無止境網(wǎng)箱養(yǎng)殖患病草魚鑒別與感染草魚Ｃｔｅｎｏｐｈａｒｙｎｇｏｄｏｎｉｄｅｌｌｕｓ屬鯉形目鯉科，是中國重要的淡水養(yǎng)殖魚類，它與鰱、鳙和青魚一起，構(gòu)成了中國著名的“四大家魚”．草魚是草食性魚類，已經(jīng)有１７００多年的養(yǎng)殖歷史［１］．由于草魚養(yǎng)殖具有周期短、肉味鮮美、經(jīng)濟(jì)效益高等特點，目前草魚已經(jīng)成為烏江網(wǎng)箱養(yǎng)殖量最大的魚類品種．然而，隨著烏江流域的工農(nóng)業(yè)發(fā)展和人口增長，每年都有大量的工業(yè)和生活污水流入烏江，使烏江水質(zhì)變差（尤其在枯水季節(jié)），魚病發(fā)生頻繁，給草魚養(yǎng)殖造成了很大的經(jīng)濟(jì)損失．因此，其病害的防治顯得十分迫切．目前，ｒＲＮＡ和ｒＤＮＡ作為分子指標(biāo)廣泛應(yīng)用于細(xì)菌遺傳特征和分子差異研
2、究［２］．大量已知細(xì)菌的ｒＲＮＡ基因數(shù)據(jù)已被測定并輸入了國際基因數(shù)據(jù)庫，成為細(xì)菌鑒定和分類的參照系統(tǒng)［３］．本研究以患病草魚為材料，對分離所得菌株采用１６ＳｒＲＮＡ基因序列測定，將測序結(jié)果輸入國際基因數(shù)據(jù)庫，通過同源性比對鑒定致病菌．然后用致病菌接種健康草魚，進(jìn)一步驗證其致病性，從而為草魚的病害防治提供病原依據(jù)．１材料與方法１．１試驗材料患病草魚標(biāo)本（５尾）于２００８年４月采自烏江上游主要支流中的偏巖河養(yǎng)殖場，采集時標(biāo)本材料個體病征相似．其中２尾草魚病癥為爛鰓、爛尾、爛鰭，體表發(fā)紅；３尾草魚病癥為爛鰓、爛鰭，體表、腸發(fā)紅，腸道出血．１．２細(xì)菌的分離用無菌棉簽分別沾取患病草魚體表患處、
3、鰓部、腸內(nèi)溶物、體內(nèi)血液、肝臟表面和肝臟內(nèi)部，并分別涂布于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上．將接種后的平板倒置于２７℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)１２ｈ．長出菌落后取出平板，將平板中不同的菌落分別轉(zhuǎn)接到空白營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板中，轉(zhuǎn)接后的平板倒置于２７℃恒溫箱中培養(yǎng)１２ｈ．重復(fù)此步驟幾輪，直至一個平板中只長有一種菌落［４］．將純化后的平板取出，對細(xì)菌的厚薄、大小、表面、邊緣、隆起形狀和顏色等進(jìn)行觀察記錄．3學(xué)海無涯學(xué)無止境１．３基因組ＤＮＡ的提取和１６ＳｒＲＮＡ基因的擴(kuò)增、測序及數(shù)據(jù)處理參見李順等［４］的方法．１．４細(xì)菌的回復(fù)感染１．４．１細(xì)菌的培養(yǎng)將分離到的細(xì)菌接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，置于２７℃隔水式恒
4、溫箱中培養(yǎng)，直至長出菌落．１．４．２細(xì)菌懸液的制備取已長出菌落的平板，在超凈工作臺上用滅菌生理鹽水洗下菌苔于試劑瓶中制成細(xì)菌懸液，保存于冰箱中（４℃）．回復(fù)感染前，將細(xì)菌懸液用滅菌生理鹽水分別以０，５，１０，１００和１０００倍梯度稀釋．１．４．３細(xì)菌懸液體積分?jǐn)?shù)測定用平板菌落計數(shù)法測定細(xì)菌懸浮液中活菌數(shù)目．各梯度菌液體積分?jǐn)?shù)（細(xì)菌密度）約為１×１０１０，２×１０９，１×１０９，１×１０８，１×１０７個／ｍＬ．１．４．４感染草魚用于回復(fù)感染的健康草魚取于烏江偏巖河養(yǎng)殖場網(wǎng)箱中，體長１５～２０ｃｍ，體質(zhì)量８０～１５０ｇ，每組１０尾．用不同體積分?jǐn)?shù)的菌液以肌肉注射（１ｍＬ／尾）和浸泡兩種方
5、式感染試驗魚（兩種方式都用以上幾種梯度的菌液感染），對照組注射相同劑量的生理鹽水．將以上試驗魚置于３ｍ×３ｍ的水泥魚池中（水深７０ｃｍ，連續(xù)充氧），連續(xù)觀察１５ｄ．２結(jié)果與分析２．１菌落外部形態(tài)和革蘭氏染色結(jié)果將純化后的平板取出，對細(xì)菌菌落進(jìn)行形態(tài)觀察，再革蘭氏染色［５］后觀察．通過比較外部形態(tài)和革蘭氏染色結(jié)果，從５尾患病草魚中共得到７株不同菌株（表１）．２．２１６ＳｒＲＮＡ基因的擴(kuò)增結(jié)果對分離到的７個菌株的１６ＳｒＲＮＡ基因進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增，均擴(kuò)增出一條約６００ｂｐ的片段（圖１）．２．３１６ＳｒＲＮＡ測序結(jié)果Ｉ菌株的測序結(jié)果（５８０ｂｐ，不包括引物序列）見表２（其余菌株的測序結(jié)果略）
6、．２．４菌株的鑒定對１６ＳｒＲＮＡ基因部分序列正、反方向測序的結(jié)果進(jìn)行拼接，拼接后的測序結(jié)果輸入到ＮＣＢＩ網(wǎng)站（）．利用ＢＬＡＳＴ工具，對序列進(jìn)行同源性比對分析，所得結(jié)果見表３．3學(xué)海無涯學(xué)無止境２．５回復(fù)感染將初步鑒定的以上細(xì)菌分別接種到健康草魚，發(fā)現(xiàn)注射感染后致病體積分?jǐn)?shù)在１×１０８～１×１０９個／ｍＬ之間．４．浸泡感染組和對照組在回復(fù)感染后的１５ｄ內(nèi)均無明顯癥狀．３討論隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的飛速發(fā)展，１６ＳｒＲＮＡ基因序列分析技術(shù)在微生物分子檢測及分類鑒定中得到了廣泛的應(yīng)用．以１６ＳｒＲＮＡ基因為目的基因的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)能精確地揭示微生物種類及遺傳的多樣性，從而使１６ＳｒＲＮＡ
7、基因序列分析成了微生物分類鑒定的主要依據(jù)，已被廣泛應(yīng)用到菌種鑒定、群落對比分析、群落中系統(tǒng)發(fā)育及多樣性的評估等領(lǐng)域，是一種客觀和可信度較高的分類和鑒定方法［６］．本研究用微生物學(xué)常用的細(xì)菌分離純化方法從患病草魚中分離出７株菌株，分別擴(kuò)增出了１６ＳｒＲＮＡ基因約６００ｂｐ的片段．一般認(rèn)為，１６ＳｒＤＮＡ序列同源性大于９９％，可以認(rèn)為屬于同一種；同源性大于９５％而小于９８％，可以認(rèn)為是同一個屬的不同種；同源性在９３％～９５％之間，可以認(rèn)為屬于不同的屬［７］．通
