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1、6第三章細菌的生長和遺傳變異-1主要內(nèi)容3-1細菌的生長及特性3-2細菌的遺傳與變異一、生長與繁殖的概念二、細菌生長的測定方法三、細菌的生長特性四、微生物膜的生長特性①涂片染色法1視野菌液(ml)＝(0.1ml／1cm2)*視野面積(cm2)計數(shù)器(血球計數(shù)板）測定法1×10-4ml菌液數(shù)了80個小格中有120個細菌，樣品中的細菌濃度是多少？(120個÷80)×400/1×10-4ml=600×104個/ml適用范圍：測定個體較大的細菌或原生動物細菌個體若太小、過多，由于每一小格中細菌層層疊加，相互
2、遮擋，難以準確計數(shù)。數(shù)數(shù)細菌（或其他微生物或細胞）數(shù)目，（一般數(shù)16×5=80個小格），折算樣品細菌濃度；②濾膜染色法一定量樣品過濾到濾膜上，然后染色計數(shù)。需要知道濾液的體積和濾膜的面積。在顯微鏡下計數(shù)，方法相同。③比例計數(shù)法比例——樣品菌液與等體積（或成一定比例）的血液混合，觀測二者比例如果平均每個視野中細菌數(shù)量/紅血球的數(shù)量比例為5.5：1，則細菌數(shù)量=？5.5×400萬個/ml=2.2×107個/mL樣品紅血球數(shù)已知(男性400~500萬個／mL，女性350~450萬個／mL)，平均400萬個
3、/mL細菌紅血球比例計數(shù)法——將已知顆粒濃度的液體與待測菌液按一定比例混合后在顯微鏡下，測各自的數(shù)目。（特點：不要求記體積）DAPI:4'6-diamidino-2-phenylindole,dihydrochloride4,6-二脒基-2苯基吲哚DNA2Cl-H2N+NH2CNHH2N-CNH2Measurementoftotalcellcounts全細胞染色法（死活不分）：DAPI染色，DTAFDAPI:無毒性熒光染料，能夠與DAN雙鏈強力結(jié)合并產(chǎn)生熒光。采用358nm紫外光照射能發(fā)射明亮的藍色
4、熒光。5-DTAF:5-(4,6-dichlorotriazinyl)aminofluoresceinDNAOOHOOHOOHNHNNClNClMeasurementoftotalcellcounts全細胞染色法（死活不分）：DAPI染色，DTAF有必要區(qū)分細菌的死活嗎？飲用水中衛(wèi)生細菌學標準是TBC<100個/mL（平板計數(shù)的標準），如果我們采用染色顯微鏡檢測技術對剛剛加氯消毒的飲用水進行檢測，可能會發(fā)現(xiàn)細菌數(shù)量會遠遠超過100個/mL，是不是飲用水就是不合格的飲用水呢？美藍染色法（酵母活細胞計數(shù)
5、）活細胞：無色死細胞：藍色活菌直接計數(shù)（DVC，DirectViableCounts）吖啶橙（AO）染色直接計數(shù)BacLight染色直接計數(shù)法N.A.法CTC染色直接計數(shù)吖啶橙（AO）染色直接計數(shù)（AODC）吖啶橙染色直接計數(shù)法（AODC）：水樣采集后迅速加入甲醛固定，甲醛最終濃度2%；取10mL固定后水樣加入0.5mL0.2%吖啶橙（AcridineOrange，Sigma公司）染色1~2min.；將染色水樣經(jīng)濾膜（孔徑0.2μm，直徑25mm，黑色聚碳酸脂濾膜，Nuclepore公司）過濾；過濾
6、后將濾膜置于載玻片上，用落射熒光顯微鏡（日本Nikon，EF-D型）計數(shù)視野中發(fā)橙色或綠色熒光的菌體；顯微鏡光源為200W汞燈，激發(fā)光濾光片為450~490nm，光束分離濾光片510nm，阻擋濾光片520nm。吖啶橙染色，在紫外顯微鏡下觀察細胞的熒光活細胞：橙色熒光死細胞：綠色熒光AODCBacLight染色直接計數(shù)法(一種核酸探針)BacLight染色直接計數(shù)法：將試劑按照產(chǎn)品要求配制后，取2mL固定后水樣加入60μL所配BacLight染色試劑，避光培養(yǎng)15~20分鐘；然后按照AODC處理方法制
7、片，觀察計數(shù)視野中發(fā)紅色或綠色熒光的菌體。所用濾光片波段同AODC相同。鏡檢計數(shù)視野中發(fā)綠色熒光的菌體為活菌。BacLightN.A.法向水樣中加入0.002%萘啶酮酸（NA，NalidixicAcid，F(xiàn)luka公司）和0.025%酵母膏（均為最終濃度），避光，25℃培養(yǎng)6h，然后2%甲醛固定，再按照AODC法直接鏡檢計數(shù)。視野中長大或變粗的菌體被認為是活菌。N.A.CTC染色直接計數(shù)——活菌計數(shù)將0.2mL1.67%的CTC加入10mL水樣中（CTC最終濃度1mM），避光室溫培養(yǎng)4h，然后2%甲
8、醛固定，再按照AODC法直接鏡檢計數(shù)視野中的紅色菌體。CTC雙重染色10μmDTAF和CTC雙重染色法rRNA核糖體核酸Oligonucleotideprobe核酸探針FluorescenceFISH（熒光原位雜交法）FluorescenceInsituhybridization16sRNA的堿基組成—設計特異的探針（probe）FISH法的步驟rRNA螢光標示探針(Probe)滲透Hybridization螢光顯微鏡觀察、計數(shù)細胞10μmFISH法DTAF染色土壤中
