最新護理查房中風后遺癥-藥學醫(yī)學精品資料.ppt

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1、最新護理查房中風后遺癥-藥學醫(yī)學精品資料免疫轉印技術一、介紹免疫轉?。╥mmunoblotting）技術又稱蛋白質印跡或Westernblot，是一種將蛋白凝膠電泳、膜轉移電泳與抗原反應相結合的新型免疫分析技術Westernblot二、原理蛋白質(病毒、細菌蛋白)經SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），根據相對分子量的大小分成區(qū)帶，然后通過轉移電泳將SDS-PAGE上的蛋白質轉印到硝酸纖維濾膜上加上相應的標記抗體（如酶標抗體、膠體金標記抗體、熒光抗體、放射性同位素標記抗體），也可先加抗體反應，再加標記的抗抗體，通過對抗體

2、的標記物的檢測，以分析特異性抗原蛋白區(qū)帶。Westernblot三、基本步驟（一）目的蛋白的分離1、經過純化的目的蛋白直接進入下一步2、未經過純化的目的蛋白需進行分離a、SDS-PAGE（根據相對分子量）b、等點聚焦電泳（根據pI）Westernblot（二）轉印轉印就是將蛋白質由SDS凝膠上轉移到固相支持物上。首選的固相支撐物是硝酸纖維濾膜（NC膜）Westernblot1、半干電轉印法：將凝膠和固相基質以三明治樣夾在緩沖液浸潤的濾紙中，電轉印10-30min2、濕法電轉印法：將凝膠和固相基質夾在濾紙中間浸在轉印裝置的緩沖液中，

3、通電轉印45min或過夜Westernblotting（三）免疫檢測1、NC膜的封閉為防止NC膜的非特異性背景著色，用封閉液對NC膜進行封閉。常用的封閉液為加有脫脂奶粉、小牛血清或牛血清白蛋白的緩沖液。Westernblotting2、靶蛋白與特異性抗體（一抗）反應將可識別靶蛋白的McAb或PcAb與NC膜一同溫育。3、靶蛋白與標記的二抗反應待上步反應結束后，洗滌NC膜，使之與標記的二抗反應，二抗可用放射性同位素、酶、生物素、膠體金等標記。Westernblot4、指示反應根據標記物的不同，可采用放射自顯影、底物顯色等，在NC膜上

4、顯示相應的檢測蛋白帶Westernblot四、Westernblot中應該注意的問題（一）首先應該確定檢測蛋白經SDS和還原劑處理后，其抗原決定簇仍然可與相應的抗體結合。特別是在用單克隆抗體作為第1抗體時應考慮這一點。Westernblot（二）要保證檢測所用抗體的特異性，尤其是一抗的特異性更為重要。另外，對一抗和標記體的使用濃度，通常要根據實際情況作適當?shù)恼{整。Westernblot（三）實驗操作過程中，拿取凝膠、濾紙和NC膜的時候，必須戴手套，因為皮膚上的油脂和分泌物會阻止蛋白質從凝膠轉移到濾膜上。Westernblot（四）

5、轉印時要注意電流的大小，過高的電流產生的熱量會在凝膠和NC膜之間形成氣泡，從而導致轉印的失敗。有報道，在轉印緩沖液中加入20%的甲醇，雖然降低蛋白質的洗脫效率，但可以提高其與硝酸纖維素結合的能力?；蛘呖梢栽诰彌_液中加入終質量分數(shù)為0.1%的SDS,也可以提高轉印效率。Westernblot五、應用免疫轉印技術是蛋白質組分分析和蛋白多肽相對分子質量分析的主要方法，已廣泛用于病毒蛋白和基因表達重組蛋白多肽的分析，是基因工中不可缺少的方法之一WesternblotOverThanks!