資源描述：
《最新焦磷酸測序技術(shù)檢測豬甲型流感病毒方法PPT課件.ppt》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、焦磷酸測序技術(shù)檢測豬甲型流感病毒方法內(nèi)容焦磷酸測序技術(shù)在動物檢疫中應(yīng)用的意義焦磷酸測序的原理焦磷酸測序檢測豬A型H1N1流感的操作過程焦磷酸測序用于豬流感檢測的意義豬A型流感：豬可能作為禽、豬、人流感病毒傳播中唯一的共同易感宿主，其呼吸道上皮細(xì)胞同時(shí)具有人、禽流感病毒的受體，所以豬流感病毒具有感染人的潛力并作為流感病毒的“混合器”,在禽—豬—人的種間傳播中起到非常重要的作用。焦磷酸測序用于豬流感檢測的意義RT－PCR、熒光RT－PCR此類方法雖特異靈敏，但可能存在假陽性反應(yīng)。解決辦法，目前對可疑結(jié)果一般采用RT－PCR產(chǎn)物序列
2、測定進(jìn)行確證。焦磷酸測序用于豬流感檢測的意義焦磷酸測序技術(shù)——分子診斷的黃金標(biāo)準(zhǔn)特異性、靈敏性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于病毒分離鑒定方法，可能存在假陽性反應(yīng)。實(shí)時(shí)熒光RT-PCRRT－PCR測序確證遭遇瓶頸瓶頸：DNA序列測定做分子克隆，需要樣品量大周期長，口岸采樣一般采集咽喉試子，經(jīng)實(shí)驗(yàn)前處理后，所剩樣品較少，且病原含量較低，PCR產(chǎn)物量根本達(dá)不到傳統(tǒng)測序所需要的量，無法進(jìn)行測序工作。本課題的主要技術(shù)手段——焦磷酸測序Pyro+Sequencing=Pyrosequencing焦磷酸技術(shù)測序技術(shù)焦磷酸測序Pyrosequencing是將焦磷酸
3、技術(shù)應(yīng)用于DNA序列分析的新一代技術(shù)分子水平上的研究最佳選擇——獲得分子診斷的黃金標(biāo)準(zhǔn)——基因序列——測序焦磷酸測序用于豬流感檢測的意義PPiATPAPS＋Luciferin＋硫酸化酶雙磷酸酶熒光素酶lighttimePyrosequencing原理DNA聚合酶實(shí)時(shí)和定量序列分析結(jié)果Samplesequence：AGGCAGTTCGAC12345678910110-1AGGCAGPyrosequencing焦磷酸測序技術(shù)的特點(diǎn)Pyrosequencing焦磷酸測序技術(shù)的特點(diǎn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)靈活I(lǐng)nterestregionRPKHDFP
4、BSeqForwardsequencingReversesequencingMultiple－sequencingprimersInterestregionSeqRPBNNtgRcFP試驗(yàn)設(shè)計(jì)理念中心理念代表各亞型目標(biāo)序列的比對尋找血凝素基因神經(jīng)氨酸酶基因鑒于最新爆發(fā)H1N1甲型流感病毒變異點(diǎn)較多，特選取該株獨(dú)有且變異點(diǎn)較為集中的區(qū)域作為目標(biāo)序列實(shí)驗(yàn)步驟PCR檢測雙酶切檢測目的基因陽性菌 測序獲得陽性克隆菌BioFlux回收試劑盒回收連接與轉(zhuǎn)化RT-PCR引物設(shè)計(jì)提取模板滅活病原提取質(zhì)粒M基因及亞型基因的質(zhì)粒構(gòu)建采樣及樣品的處
5、理鼻腔拭子肌肉或組織臟器應(yīng)盡可能多保留一些樣品，因?yàn)榱鞲械奶厥庑裕赡苄枰貜?fù)實(shí)驗(yàn)。RNA提取采用常規(guī)方法試劑只要適合于RNA提取即可試驗(yàn)進(jìn)程（PCR）及電泳直接進(jìn)行H1、N1基因的PCR擴(kuò)增采用兩步法電泳檢測PCR擴(kuò)增結(jié)果根據(jù)提供的擴(kuò)增片段長度確定是否擴(kuò)增到目標(biāo)片段如有雜帶，可以增加純化步驟試驗(yàn)進(jìn)程及結(jié)果PCR試樣預(yù)處理Pyrosequencing反應(yīng)實(shí)驗(yàn)流程：分離純化單鏈開機(jī)，并拿出試劑，在使用前，保證所有試劑都達(dá)到室溫混勻磁珠，在Mixer上常溫混勻10分鐘，每樣約3μL加入結(jié)合緩沖液到50uL將50μL標(biāo)記有生物素的P
6、CR產(chǎn)物與50μL鏈霉親和素包被的磁珠混合，在室溫25℃下振蕩孵育20min。用真空吸附器將與磁珠結(jié)合后的PCR產(chǎn)物吸起，然后在純水中清洗30s；在70%乙醇中清洗5s；變性緩沖液洗5s；最后移到洗滌緩沖液中清洗10s。空吸附器放入含有測序引物的板中，搖動，釋放磁珠。將樣品放入80℃烘箱2min，再冷卻到室溫。InstrumentdesignReagentcartridge96wellplateCCDcameraX-YdriveInkjetdeliveryMixerandthermostatDetectionPositioni
7、ngTACG實(shí)驗(yàn)流程：Pyrosequencing檢測測序反應(yīng)測序反應(yīng)在28℃下于焦磷酸測序儀上檢測，加樣使用600mbar/8msec的加樣壓力和時(shí)間，每輪反應(yīng)時(shí)間65秒。引物鏈隨著不同dNTP的加入而延伸。隨著核酸的結(jié)合，CCD攝像機(jī)檢測到發(fā)出的光信號，讀出DNA序列。標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)結(jié)果判定豬甲型H1N1流感病毒的確定：H1和N1RT-PCR反應(yīng)均為陽性的，進(jìn)行焦磷酸測序分析，測序片段與H1、N1目標(biāo)片段完全相同的，確定為豬甲型H1N1流感病毒亞型。H1和N1RT-PCR反應(yīng)均為陽性的，H1和N1測序片段與目標(biāo)片段有一個(gè)以上堿
8、基不同定為可疑，進(jìn)行HA或NA基因全序列測定，確定其亞型。H1、N1RT-PCR反應(yīng)全部或有一個(gè)為陰性的判定為非豬甲型H1N1流感病毒。標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)結(jié)果判定甲型H1N1流感病毒的確定中確定為豬甲型H1N1流感病毒的樣品，建議采用本標(biāo)準(zhǔn)附錄B.3中的引物，按本標(biāo)準(zhǔn)的方法及判定依據(jù)
