dna提取試劑的作用

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1、DNA提取試劑的作用1.CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)：是一種陽離子去污劑,具有從低離子強度溶液中沉淀核酸與酸性多聚糖的特性.在高離子強度的溶液中(>0.7mol/LNaCl),CTAB與蛋白質(zhì)和多聚糖形成復(fù)合物,只是不能沉淀核酸.通過有機溶劑抽提,去除蛋白,多糖,酚類等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來.注:CTAB溶液在低于15℃時會形成沉淀析出,因此在將其加入冰冷的植物材料之前必須預(yù)熱,且離心時溫度不要低于15℃.2．Tris-HCl：提供一個緩沖環(huán)境,防止核酸被破壞;3.EDTA：螯合Mg2+或

2、Mn2+離子,抑制DNase活性;4.NaCl：提供一個高鹽環(huán)境,使DNP充分溶解,存在于液相中;5.β-巰基乙醇：抗氧化劑,有效地防止酚氧化成醌,避免褐變,使酚容易去除。6.PVP(聚乙烯吡咯烷酮)：酚的絡(luò)合物,能與多酚形成一種不溶的絡(luò)合物質(zhì),有效去除多酚,減少DNA中酚的污染;同時它也能和多糖結(jié)合,有效去除多糖.7.氯仿：使蛋白變性并有助于液相與有機相的分開8.異戊醇的作用是消除抽提過程中出現(xiàn)的泡沫。氯仿是強蛋白質(zhì)變性劑，抑制RNA酶的活性，除去蛋白質(zhì)污染。9.溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌體細胞壁的

3、主要化學(xué)成分肽聚糖中的β-1,4糖苷鍵，10.SDS：SDS是離子型表面活性劑，溶解膜蛋白而破壞細胞膜，解聚細胞中的核蛋白，使蛋白質(zhì)變性而沉淀下來。11.3mol／L?NaAc：有利于變性的大分子染色體DNA、RNA以及SDS-蛋白復(fù)合物凝聚而沉淀之。12.無水乙醇：乙醇會奪去DNA周圍的水分子，使DNA失水而易于聚合13.蛋白質(zhì)的去除:酚/氯仿抽提；使用變性劑變性(SDS,異硫氰酸胍等)多糖的去除:高鹽法:用乙醇沉淀時,在待沉淀溶液中加入1/2體積的5MNaCl,高鹽可溶解多糖.多酚的去除:在抽提液中加入

4、防止酚類氧化的試劑:β-巰基乙醇,抗壞血酸,半胱氨酸,二硫蘇糖醇等加入易與酚類結(jié)合的試劑:如PVP(聚乙烯吡咯酮),PEG(聚乙二醇),它們與酚類有較強的親和力,可防止酚類與DNA的結(jié)合鹽離子的去除:70%的乙醇洗滌核酸吸附,沉淀和溶解使用合適的吸附材料吸附核酸,4．為什么用無水乙醇沉淀DNA？用無水乙醇沉淀DNA，這是實驗中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的優(yōu)點是可以任意比和水相混溶，乙醇與核酸不會起任何化學(xué)反應(yīng)，對DNA很安全，因此是理想的沉淀劑。DNA溶液是DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，當(dāng)加入乙醇時，乙醇會

5、奪去DNA周圍的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般實驗中，是加2倍體積的無水乙醇與DNA相混合，其乙醇的最終含量占67％左右。因而也可改用95％乙醇來替代無水乙醇（因為無水乙醇的價格遠遠比95％乙醇昂貴）。但是加95％的乙醇使總體積增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA損失也增大，尤其用多次乙醇沉淀時，就會影響收得率。折中的做法是初次沉淀DNA時可用95％乙醇代替無水乙酵，最后的沉淀步驟要使用無水乙醇。也可以用0.6倍體積的異丙醇選擇性沉淀DNA。一般在室溫下放置15－30分鐘即可。5．在用乙

6、醇沉淀DNA時，為什么一定要加NaAc或NaCl至最終濃度達0.1～0.25mol/L？在pH為8左右的溶液中，DNA分子是帶負(fù)電荷的，加一定濃度的NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的負(fù)電荷，減少DNA分子之間的同性電荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA鈉鹽沉淀，當(dāng)加入的鹽溶液濃度太低時，只有部分DNA形成DNA鈉鹽而聚合，這樣就造成DNA沉淀不完全，當(dāng)加入的鹽溶液濃度太高時，其效果也不好。在沉淀的DNA中，由于過多的鹽雜質(zhì)存在，影響DNA的酶切等反應(yīng)，必須要進行洗滌或重沉淀。6．加核糖核酸酶降解核

7、糖核酸后，為什么再要用SDS與KAc來處理？加進去的RNase本身是一種蛋白質(zhì)，為了純化DNA，又必須去除之，加SDS可使它們成為SDS-蛋白復(fù)合物沉淀，再加KAc使這些復(fù)合物轉(zhuǎn)變?yōu)槿芙舛雀〉拟淃}形式的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，使沉淀更加完全。也可用飽和酚、氯仿抽提再沉淀，去除RNase。在溶液中，有人以KAc代替NaAc，也可以收到較好效果。7．為什么在保存或抽提DNA過程中，一般采用TE緩沖液？在基因操作實驗中，選擇緩沖液的主要原則是考慮DNA的穩(wěn)定性及緩沖液成分不產(chǎn)生干擾作用。磷酸鹽緩沖系統(tǒng)（pKa＝7

8、.2）和硼酸系統(tǒng)（pKa=9.24）等雖然也都符合細胞內(nèi)環(huán)境的生理范圍(pH)，可作DNA的保存液，但在轉(zhuǎn)化實驗時，磷酸根離子的種類及數(shù)量將與Ca2＋產(chǎn)生Ca3(PO4)2沉淀；在DNA反應(yīng)時，不同的酶對輔助因子的種類及數(shù)量要求不同，有的要求高離子濃度，有的則要求低鹽濃度，采用Tris-HCl（pKa=8.0）的緩沖系統(tǒng)，由于緩沖液是TrisH+/Tris，不存在金屬離子的干擾作用，故在提取或保存DNA時，大都采