分子生物學課件chap2-3_2010

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2.3.9.三股螺旋DNA(TribleHelixDNA,T.SDNA)潛在的專一與DNA(蛋白質)結合的能力※T.SDNA的發(fā)現(xiàn)與證實l1953年以前Pauling(Chemist)提出T.SDNA存在的可能性l1953年Watson&CrickD.SDNAmodel證明沿大溝存在多余的氫鍵給體與受體形成T.SDNA可能性DNA結構領域與Watson競爭，支流?主流? l1957年Davis,Felsenfeld,Rich發(fā)現(xiàn)poly(U)+poly(U)+poly(A)T.SRNAT.SDNA的概念l1966年Miller&Sobell實現(xiàn)RNA+D.SDNATriblepolyNtasRepressor關閉基因但由于D.SDNA的提出而被忽視但因證明LacI產(chǎn)物為Repressor而被忽視 ●1975年Perlgut人工合成T.SDNA并證明其Tm值,沉降系數(shù)(S)l1987年Mirkin.S.MNature330(495)證明plasmidDNA在pH=4.3的溶液中,有T.SDNA的存在●1987年Dervan.MoserScience238(645)合成S.SDNA+D.SDNA→T.SDNA實現(xiàn)DNA的定點切割研究X-rayphotograph核磁共振→結構功能 繼Davis（1957）后30年第一次證明T.SDNA在生物體內的存在 ※T.S.DNA的類型PolyT/ATTTTTTTTTTTAAAAAAAAAAPolyT/ATTTTTTTTTTTAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTAAAAAAAAAA●D.S.DNA+D.S.DNAT.S.DNA+S.S.DNA ●HomologouspalindromicsequenceinaD.S.DNA(mirrorimagestructure)-------TTCCCTCTTTCCC------CCCTTTCTCCCTT-------------AAGGGAGAAAGGG---GGGAAAGAGGGAA----Mirkin(1987)pGG332plasmidDNA--------TTCCCTCTTTCCC----------------AAGGGAGAAAGGG---------------TTCCCTCTTTCCC-----------------AAGGGAGAAAGGG-------NoduleDNAHingedDNAfreeDNA HomologouspalindromicsequenceinaD.S.DNANoduleDNAorHingedDNA三鏈螺旋雙鏈螺旋HingedDNAHingedDNA lS.S.DNA+D.S.DNAT.S.DNA☆PU+PU/PY(偏堿性介質中穩(wěn)定)☆PY+PU/PY(偏酸性介質中穩(wěn)定)常見類型第三條鏈位于B-DNA的Majorgroove中與D.S.DNA一起旋轉 T.S.DNA的連接鍵WatsonbondingA＝TG≡C(D.S.DNA)H+Hoogsteenbonding第二鏈的pu6‘,7’與第三鏈的py4‘,3’形成H鍵G＝C+(pH小于7)第三鏈質子化G(6,7)＝G(1,2)A＝AG＝A+A＝T? 三股螺旋DNA形成的條件及結構特點第三條單鏈DNA分子位于B-DNA大溝內與B-DNA以Hoogsteen鍵連接在Py/Pu(A,G):Pu(A,G)結構中有多種配對方式，鏡向結構,非必需條件TriblehelixMajorgroovePy:Pu:Py3ed在Py/Pu:Py結構中AT,GC兩氫鍵配對C質子化鏡相結構必需條件 l無論何種形式的三螺旋DNA,第二股中間鏈必須是Purin鏈l第三股鏈至少長于8dNtl真核生物基因組內,約1%左右的序列為大于100bp的homologouscluster(重復序列與調控序列)T.S.DNA多存在于其中 T.S.DNA可能的功能可阻止調節(jié)蛋白與DNA結合,關閉基因轉錄過程micro－RNAEpigenetic!b)與基因重組,交換有關加入第三條S.S.DNA作為分子剪刀(molecularscissors),定點切割DNA分子d)加入反義的第三條鏈(anti-sencepolydNt)終止基因的表達 2.3.10.四股螺旋DNA(tetraplexDNA,tetrableHelixDNA，quadruplexDNA)發(fā)現(xiàn)1958.Poly(I)X-rayphotograph堿基形成環(huán)狀氫鍵連接結構TetrableHelixDNA均有形成四股螺旋DNA的可能5’---TTAGGGTTAGGGTTAGGG-3’3’---AATCCCAATCCC-5’Poly(G),4(dG)染色體端粒高度重復的DNA序列著絲點附近的高度重復序列 結構特點LinkedbyHoogsteenBonding6－17－27GGGG6767766 2×poly(T4G4)2×poly(G4C4)結構特點 GGGGTTTGGGGTTTGGGGTTT真核生物染色體端粒DNA結構G-quadruplex5‘3‘TTTGGGGGGGGGGGGGGGGGGTTTTTT 可能的功能A穩(wěn)定真核生物染色體結構B保證DNA末端準確復制C與DNA分子的組裝有關D與染色體的meiosis&mitosis有關HoogsteenBonding5’-----TTAGGGTTAGGGTTAGGGT3’-----AATCCCAATCCCGGGTA 可能的功能E.G-quadruplex阻止端粒酶對端粒DNA的延伸（因為G-quadruplex不是端粒酶的底物）5’-----TTAGGGTTAGGGTTAGGGT3’-----AATCCCAATCCCGGGTAG-quadruplex的邊序直接影響其結構的穩(wěn)定性! 2.4.基因概念的多樣性 2.4.1.生物進化的C值矛盾(Cvalueparadoxofnucleotide)ThetotalamountofDNAinthegenomeofhaploidIsacharacteristicofeachlivingspeciesknownasitsMaximumCvalue(單倍體基因組總DNA的含量)最大C值(MaximumCvalue)ThetotalamountofDNAforencodingthegenesinformationistermeditsMinimumcvalue（編碼基因信息的總DNA含量）最小C值(Minimumcvalue) Cvalueparadoxofnucleotide霉菌藻類G+細菌G-細菌顯花植物鳥類哺乳類爬行類兩棲類硬骨魚類軟骨魚類棘皮類甲殼類昆蟲類軟體動物蠕蟲類真菌支原體A生物體進化程度高低與大C值不成明顯相關（非線性）B親緣關系相近的生物大C值相差較大C一種生物內大C值與小c值相差極大（Euk.人體c=C/10）(Prok.Φx174c＞C) 2.4.2.重疊基因(overlappinggene)F.Sanger1977X174dntsequencingC=5387bpc=11×2000bp 2.4.2.1基因重疊方式Mis-readingforstopcodon(Q?RNAvirus1973.A.Weiner)400Nt800NtAUG----------------------UGA-----------------------UAAUGA,UAG易被漏讀，錯讀UAA能嚴格終止14KdCp97%38KdIp3% X174(F.Sanger,1977)Alternatedifferentreadingframe5387bp11genes3mRNA9peptidesC=5387bpc=11×2000bp---ATG-----//------AATGCC----//---ATAACG---//--TAA----ABATGCCN----NNATAA --------------TCAUGCCCAAACUAGGC--------------StartStopstopstartAlternatedifferentreadingframe ---AUG--------TCAUGCCCAA----AUGAGGC--------------Vp2StartSelectiondifferentstartcodonorstopcodon(SimianVirus40SV40)SV40Vp1StartVp3StartVp1Vp2Vp3 2.4.2.2.種類※I類；反向重疊基因（重疊基因分布在同一DNA區(qū)域的不同單鏈上）IAICIDIB方式？!?!功能？! ※II類；同向重疊基因（重疊基因分布在同一DNA區(qū)域的同一單鏈上）方式？IIAIIBIICIID b)遺傳信息量的估算突變效應的鑒定表達調控的理論發(fā)展c)豐富和發(fā)展了基因的概念(部分回答C=c)2.4.2.3.重疊基因的生物學意義a)原核生物進化的經(jīng)濟原則(較小的C值編碼較多的基因信息) 2.4.3重復基因(Repetitivegene) 135001.7×1054.2×106bpK.C.2×10-68×10-23×10-19Cot1/22.4.3.1.重復序列的發(fā)現(xiàn)與證實Why? 單一序列長度愈小（重復度愈大）kineticcomplexity(K.C.）愈小Cot(1/2)值愈小，復性愈快poly(A)K.C.=1Cot(1/2)=2×10-6T4DNAK.C.=1.7×105Cot(1/2)=0.3E.coliDNAK.C.=4.2×106bpCot(1/2)=9 C0t(1/2)ofanygenomeDNAC0t(1/2)ofE.ColiDNAKineticComplexityofanygenomeDNAKineticComplexityofE.ColiK.C.與Cot(1/2)值呈正比 K.C.與Cot(1/2)值呈正比poly(A)K.C.=1;Cot(1/2)=2×10-6比例常數(shù)K＝K.C./Cot(1/2)=1/2×10-6=5×105K.C.=K×Cot(1/2)T4DNAK.C.=1.7×106;Cot(1/2)=0.3比例常數(shù)K≈1.7×106/0.3=5×105E.coliDNAK.C.=4.2×106bp;Cot(1/2)=9比例常數(shù)K≈4.2×106/9=5×105 在特定的實驗條件下盡管不同的DNA分子K.C.值不同，Cot(1/2)也不相同，但他們的比例常數(shù)是相同的K=5×105K.C.與Cot(1/2)值呈正比K.C.=K×Cot(1/2)Bp＝(bp×L/M×S)×(M×S/L)任一DNA分子K.C.＝5×105×Cot(1/2) 1CotCt/C013/605/61/60.110含有復性速率不同的兩個以上的組分1/6C/C0=Cot(1/6)1025/6C/C0=Cot(5/6)●真核生物復性動力學研究理想曲線Cot(1/2)=1K.C.=K×Cot(1/2)＝5×105×Cot(1/2)=5×105(Britten&Kohne1968)參與復性的組分是單質的1/6Ct/C0=Cot(1/6)1025/6Ct/C0=Cot(5/6) ●真核生物復性動力學研究C0t1/6C/C0=Cot(1/6)102CalfthymusDNA含有兩個以上的K.C.不同的組分5/6C/C0=Cot(5/6)Ct/C06105／61／63／610－2E.ColiDNA30000.0340%60%103CalfthymusDNA C0t(1/2)值矯正40%×0.03=0.01260%×3000=1800C0t(1/2)ofE.ColiDNA=6KineticComplexityofE.Coli=4.6×106C0t(1/2)ofanygenomeDNAC0t(1/2)ofE.ColiDNAKineticComplexityofanygenomeDNAKineticComplexityofE.Coli 60%DNA的總長度=單一序列的KineticcomplexityX=13.8×108bp40%DNA的總長度(chemicalcomplexity)13.8×108bp×4/6=9.2×108bp1800X64.6×106= 40%DNA中單一序列的Kineticcomplexity40%DNA序列中單一序列的重復次數(shù)（F）0.012Y64.6×106=Y=9200bpRepetitivefrequency=C.C/K.C=9.2×108bp/9200bp=100,000copies 40%DNA的總長度(chemicalcomplexity)XK.C=1800×5×105bp=9×105bp9×105bp×4/6=6×108bp60%DNA的總長度=單一序列的KineticcomplexityC0t(1/2)值矯正40%×0.03=0.01260%×3000=1800K.C.=K×Cot(1/2) 40%DNA中單一序列的Kineticcomplexity40%DNA序列中單一序列的重復次數(shù)（F）Repetitivefrequency=C.C/YK.C=6×108bp/6000bp=100,000copiesYK.C=0.012×5×105bp=6000bpC0t(1/2)值矯正40%×0.03=0.01260%×3000=1800 2.4.3.2重復序列復性的相對性D.S.DNA94℃S.S.DNARenatureatlowC0t(1/2)Hydroxyapatitecolumn高度重復的D.S.DNATm低于該部分天然DNA值S.S.DNARenatureatmiddleC0t(1/2)How? S.S.DNARenatureathighC0t(1/2)單一序列的D.S.DNATm幾乎接近該部分天然DNA值中度重復的D.S.DNATm稍低于該部分天然DNA值? Tm接近天然D.SDNA的TmTm低于天然D.SDNA的Tm單一序列的S.S.DNA復性D.S.DNA復性D.S.DNA重復序列的S.S.DNA高C0t(1/2)低C0t(1/2) 結果表明：a)Non-repetitiveS.S.DNARenaturedbyexactlypairingb)RepetitiveS.S.DNAMorerenaturedbypartiallypairingMoreinexactlypairingandmis-pairing天然DNA與復性DNA之間比較?Tm相差1－1.5度時，預計約有1％的堿基錯配 部分配對，錯誤配對愈多，變性時Tm值愈低PCR,分子雜交中，雜交溫度（復性）一般為Tm－(25~30℃)=55~65℃高于55~65℃，為高嚴謹雜交條件（用于單一序列探針）低于55~65℃，為低嚴謹雜交條件（用于重復序列探針）Why? 利用水稻基因的探針與玉米根尖染色體細胞學制片進行原位分子雜交時(FISH)，使用玉米C0tDNA進行預雜交，結果發(fā)現(xiàn)：玉米DNAC0t值分別為10，50，100時的雜交效果不同，為什么？C0t=10C0t=50C0t=100 2.4.3.3.重復序列分類a)高度重復序列(Highrepetitivesequence)MicrosatelliteDNA2-10bp/copy105-106copies/genomeC0t(1/2)<0.001多為串聯(lián)重復排列分布于著絲點,端粒區(qū),結構基因兩側heterochromatin5-50copies/genomeMinisatelliteDNA(Variablenumbertandemrepeats.VNTR) 104bpfragmentCsClgradientcentrifugationSequenceinsatelliteDNASeacrab2ATATAT…..Drosophila5ATAATATAAT…..Mouse9GAAAAATGAGAAAAATGAbpofrepeatunitsequenceProkaryoteEukaryote(GC%)42413455MOUSECALF 高度重復序列（micro-satellite）不編碼結構基因（功能？）無選擇壓力（multipleallele可保留在群體中）（有效的分子標記，SSRsimplesequencerepeat）CNV(copynumbervariation)! b)中度重復序列(middlerepetitivesequence)0.1-1Kb/copy10-104copies/genomeC0t(1/2)~0.001-0.1rDNAtDNAAlufamilyHistonegenecluster rDNAgenefamilySeaurchin450copiesTobacco750copiesDrosophila100copiesT18sT5.8sT28sNT18sT5.8sT20s32s28s5.8s45s41s18s不同的生物不同發(fā)育時期會發(fā)生不同程度的擴增5srDNA5s5s5s5s5s上萬次重復 靈長類動物特有的Alufamily人類500,000copies分布于非重復序列間，占基因組5－6％Function?300bp300bp300bp6000bp6000bp6000bp6000bpDRDRIRIRAGCTAlusiteAcopyofAlufamilyTransposon?遺傳性疾病Aluexon的發(fā)現(xiàn)，表明Alu單元在不危及基因組完整的前提下，具有增強基因組編碼容量，產(chǎn)生新基因及調控多能性的進化潛力 middlerepeatgene特點clustergenetandemgeneredundantgene拷貝重復，多量序列多為相似排列成束功能完全相同具有進化的整體性，累積突變rDNAtDNAHistone數(shù)量性狀基因QTG（量多，微效?效等?累加）不等于中度重復基因 StructureofrepetitivesequenceofDNADRdirectrepeatsIRInvertedrepeatsATCGGCTATAGCCGATBilateralsymmetryATCGNNNNNGCTATAGCNNNNNCGATBilateralsymmetryATCGATCGATCGTAGCTAGCTAGCTandemdirectrepeatsATCGNNNATCGNNNNNNATCGTAGCNNNTAGCNNNNNNTAGCDisperseddirectrepeatsATCGNNNNNCGATTAGCNNNNNGCTAStem-looppalindrome----AAGCTT--------TTCGAA----HindIIIREMirrorStructure ATCGNNNNNNNNCGATATCGTAGCWhenS.S.DNAdNtscontainstwosequencesthatarecomplementary,andformahairpinorstem-loopstructure.StructureofInvertedrepetitivesequence(IR)ofDNA ATCGNNNNNCGATTAGCNNNNNGCTAATCGTAGCCGATGCTAInD.S.DNAsuchstructureconsistoftwocopiesofanidenticalsequencepresentintheinvertedorientation c)單拷貝序列(singlecopysequence,1-3copies)低等真核生物10-20%高等植物80%repetitivesequence高等動物50%多為結構基因 2.4.3.4.重復序列形成的理論a)滾環(huán)擴增—突變(Amplification-Mutation)Mutationinsertioncyclingamplification5‘切離環(huán)化3‘3‘3‘滾環(huán)復制 DNA→RNA→DNAmRNA/cDNADScDNAb)反轉座插入(retro-transposition) 跳躍復制saltatoryreplicationCAACMutationin4siteInsertCInserttriplemutationSaltatoryreplication9bprepeat27bprepeat58bprepeat58bprepeat116bprepeat 基因的重復可以通過復制產(chǎn)生（duplication）復制后的拷貝發(fā)生突變和突變累積(divergence)形成基因簇genecluster分化成執(zhí)行不同功能的基因 Geneduplicationisamajorforceinevolution抗病基因簇的形成 不對稱交換(unequalcrossing-over) unequalcrossing-over5Units5Units6Units4Units 基因組比較研究禾本科植物基因組比較 ●基因組比較研究表明；5×RicegenomeMaizegenome40×RicegenomeWheatgenome但基因組成，排列表現(xiàn)驚人的相似差異多存在于repetitivesequence﹤﹤ 2.4.4.間隔基因（splittinggene）PhillipSharp&RobertsAd2(1977)（minirevolution）RichardJ.RobertsPhillipA.SharpNobelPrize1993PierreChambon(France)(1977)ovalbuminofchickenEukaryoticcellulargeneisalsosplit2.5.4.1.間隔基因的發(fā)現(xiàn) PhillipA.SharpNobelPrize1993（49y）2006.2.13布什給PhilipSharp頒發(fā)國家科技獎章曾獲得40項獎勵，擁有4個院士稱號（美國科學院、美國文理科學院、美國醫(yī)學研究院、美國哲學研究院） E.coliKeop=1eop=10-4ofλkefficiencyofplating(eop)=10-3ofλcE.coliCλphageeop=1●限制性核酸內切酶的發(fā)現(xiàn)1965Arber.W a)E.colirestrictionalienDNAwithrestrictionendonuclease(RE)b)Modificationenzymeinhostc)AlienDNAfateofberestrictedorbemodifiedd)TherearedifferentREindifferenthostofbacterialWernerArberNobelPrize1978 lRestrictionEndonuclease的種類 ●Splittinggene的證實1977PierreChambonOvalbumincDNAasprobeEcoRIHindIIIOviductDNAErythrocyteDNAcDNA中沒有HindIII，EcoRI切點！？ Splittingseq.inthe5’endofHexoncpgeneofAd2DNAofAd2+EcoRI&HindIIImRNAofHexoncpSharpgroupRobertsgroup1977AndpresentationinCSHPNAS74:3173,1977 TotalDNAofchickencDNA7DNAloopChambonwasinspiredbyBerget’sreportBerget,S.M.,C.Moore,andP.Sharp.1977.PNAS74;3171-3175 OvalbumincDNAREmapHinfIHinfIIHeaIIIHinfIIIPstIHinfIV(NoEcoRIHindIIIREsite)thecDNAprobebedigestedbyHinfIIIandPstILabelingwithp32ProbeAProbeCProbeB ProbecDNAABCOviducttotalDNADigestedwithEcoRIandHindIIIpresume HinfIHinfIIHeaIIIHinfIIIPstIHinfIVEcoRI,HindIIIEcoRI,HindIIISpacerSpacercDNAmRNApresumeHinfIHinfIIHeaIIIHinfIIIPstIHinfIVDNA轉錄逆轉錄雖機會錯過但推論正確