液相色譜分析方法的建立

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1、一.??方法建立的步驟二．開始前應(yīng)知道1.?樣品的性質(zhì)在開始方法建立之前，我們應(yīng)該檢查自己對樣品的了解程度，并明確分離目標(biāo)。表?1?有關(guān)樣品組分和性質(zhì)的重要信息所含化合物的數(shù)目化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)（官能團(tuán)）化合物的分子量化合物的pKa值化合物的UV光譜圖化合物在樣品中的濃度范圍樣品的溶解度樣品的化學(xué)成分能夠為選擇HPLC分離的最佳初始條件提供有價值的線索根據(jù)已知的樣品信息，HPLC方法建立有兩種不甚相同的模式。一種模式依據(jù)樣品的“化學(xué)性質(zhì)”選擇最佳初始條件，色譜工作者需很大程度依賴于過去的經(jīng)驗（如類似結(jié)構(gòu)化合物的分離）和/或

2、用文獻(xiàn)資料補(bǔ)充現(xiàn)有信息而另一種模式則直接開始色譜分離，而對樣品的性質(zhì)不大注意這兩種HPLC的方法建立模式可分別稱為理淪型與經(jīng)驗型初始分離一旦開始，可以根據(jù)類似的思路（理論的與經(jīng)驗的）選擇進(jìn)一步的實驗。2.分離的目的HPLC分離的目的必須十分明確，下面的問題在建立方法之初就應(yīng)確定：（1）主要目的是什么？定量或定性，還是定性、定量同時做？；（2）是否有必要解析出樣品的所有成分？譬如可能有必要分離出產(chǎn)品中的所有降解物或雜質(zhì)，以使含量測定結(jié)果更加可靠，但卻沒必要將它們彼此完全分開。（3）如要求定量分析，準(zhǔn)確度與精密度需多大？樣品

3、主要成分的精密度通常能達(dá)到±1—2%，特別是不需樣品預(yù)處理的情況。（4）特殊化合物可能會以不同的樣品形式出現(xiàn)（如：原料藥，一種或多種形態(tài)，環(huán)保樣品等）。是否需要一種以上的HPLC方法？單一方法分離不同形態(tài)樣品是否理想？（5）一次將分析多少樣品？當(dāng)必須同時處理大量樣品時，運行時間將變得非常重要。有時甚至為了縮短運行時間而以犧牲樣品分離度作代價，如縮短柱長或加快流速。當(dāng)一次分析的樣品數(shù)目超過10個，運行時間一般應(yīng)控制在20min以內(nèi)。（6）將要使用該方法的實驗室中，有哪些HPLC設(shè)備？色譜柱能否恒溫系統(tǒng)能否做梯度洗脫？該方法

4、是否可在不同設(shè)計與生產(chǎn)的設(shè)備上運行？????方法建立實驗開始之前，應(yīng)明確對方法的這些要求。三.?樣品的預(yù)處理和檢測??1.??預(yù)處理：樣品來源形式不同，可能以如下形式出現(xiàn)：??????（1）?可直接進(jìn)樣的溶液；:??????（2）?需稀釋、pH緩沖、加人內(nèi)標(biāo)或其它定容操作的溶液；??????（3）?必須首先溶解或提取處理的固體；。??????（4）?樣品需預(yù)處理以除去干擾物和/或保護(hù)色譜柱或儀器不受損害。???可直接進(jìn)樣的樣品有操作方便、精密度好的優(yōu)點，然而大多數(shù)HPLC分析的樣品需稱重或稀釋定容后才能進(jìn)樣。當(dāng)樣品溶劑成

5、分接近于流動相時，一般不會產(chǎn)生基線波動等問題，通常能夠得到較好的結(jié)果。有些樣品在注入HPLC前需進(jìn)行部分分離（預(yù)處理），以除去干擾物、濃縮樣品或消除“柱殺手”，因此了解樣品和各種被測物的濃度范圍非常重要。??2.??檢測：HPLC方法建立期間，在第一次進(jìn)樣前，我們必須有把握所選擇的檢測器能檢測到所有的被測樣品組分。通常首選可變波長紫外(UV)檢測器，因這種檢測器使用方便，且可用于大多數(shù)樣品。UV光譜數(shù)據(jù)可從文獻(xiàn)中查找，也可通過所測樣品成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)估算，直接測得（如果可拿到化合物純品）或在HPLC分離期間用二極管陣列檢測

6、器（PDA）得到。樣品對UV檢測響應(yīng)不足時，可考慮使用其它類型檢測器(熒光，電化學(xué)等)，或衍生化樣品使檢測信號增強(qiáng)。四.?建立分離方法1.?選擇HPLC分離模式與起始條件首先，我們要確定使用什么方法最合適；如果我們選定HPLC分離模式，將樣品分為一般樣品或特殊樣品。一般樣品為小分子典型混合物，用近乎標(biāo)準(zhǔn)化的起始條件即可分開。而樣品特殊需用特殊的色譜柱和特定的條件才能很好地分離。一般樣品可進(jìn)一步分為中性或離子樣品。離子樣品包括酸、堿、兩性化合物和有機(jī)鹽類(電離的強(qiáng)酸或強(qiáng)堿)。如樣品為中性，一般不需在流動相中加緩沖液或添加劑

7、，但對于酸或堿性樣品，通常需在流動相中加入緩沖劑。堿性或陽離子樣品，推薦用“弱酸性”的反相色譜柱，流動相中加人胺添加劑可能對分離有利。首次實驗完成后，再按照結(jié)果系統(tǒng)地加以進(jìn)一步完善。樣品的性質(zhì)HPLC????????GC?????????CE?????????SEC????????TLC一般樣品?????????????????特殊樣品中性的??????????離子的?????????無機(jī)離子異構(gòu)體??????????????????????????????對映體生物樣品等??度????????????????????肽

8、?類糖?類梯??度?????????????????大分子蛋白質(zhì)離子對????????????????????核??酸糖??類正??相??????????????????合成聚合物圖1.?利用樣品的有關(guān)條件，選擇初始實驗分離條件??表2??特殊樣品的處理樣品要求無機(jī)離子檢測為主要問題；使用離子色譜異構(gòu)體有些異構(gòu)體能用