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《western_blot_試劑配制及操作流程》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內(nèi)容在應用文檔-天天文庫。
1、Western-Blot操作流程試劑配制蛋白提取試劑1.RIPA裂解液：50mMTris（MW121.14，PH7.5）3.02g150mMNaCl4.38g1%TritonX-1005ml1%脫氧膽酸鈉5g0.1%SDS0.5g蒸餾水至500ml。調(diào)pH值至7.5?；靹蚝?℃保存，長期保存于-20℃。使用時，加入蛋白酶抑制劑cooktail。2.蛋白酶抑制劑cooktail所需母液成分：（1）100mmol/LPMSFPMSF17.4mg異丙醇1ml溶解后，分裝于1.5ml離心管中，-20℃保存。（2）10mM亮肽素leupeptin:-20℃保存
2、（3）2.1mg/ml抑肽素Aprotinin:4℃保存配制：成分終濃度每ml裂解液所加母液量PMSF1mmol/L（儲存濃度稀釋100倍）10ulLeupeptin0.1mmol/L（儲存濃度稀釋100倍）10ulAprotinin1ug/ml（儲存濃度稀釋2000倍）0.5ul各成分直接加入所用的RIPA裂解液中，之后按照60ul/孔（12孔板）提取蛋白。蛋白定量試劑1.G250考馬斯亮藍溶液（蛋白定量專用）考馬斯亮藍G250100mg95％乙醇50ml85％磷酸100ml蒸餾水至1000ml配制時，先用乙醇溶解考馬斯亮藍染料，再加入磷酸和水，混
3、勻后，用濾紙過濾，4℃保存于棕色瓶中。2．牛血清白蛋白BSA儲存液（1mg/ml）：100mgBSA粉末溶于20ml雙蒸水，定容至100ml，加少量防腐劑，4℃保存。上樣用試劑1．4X上樣緩沖液1.0mol/LTris·HCl（pH6.8）2mlSDS0.8g溴酚藍0.04g甘油4ml去離子水定容至10ml?；靹蚝?，分裝于1.5ml離心管中，4℃保存。使用時稀釋成1X。2．1.0mol/L二硫蘇糖醇（DTT）（10X）用20ml0.01mol/L乙酸鈉溶液（pH5.2）溶解3.09gDTT,分裝成1ml小份儲存于-20°C。使用時稀釋成1X。例如：上
4、樣量20μl--4X上樣緩沖液5μl+DTT2μl+樣本蛋白13μl工作液制膠用（1-6）：1.1.0mol/LTris·HCl（pH6.8）Tris(MW121.14)12.114g蒸餾水100ml溶解后，（用濃鹽酸調(diào)pH至6.8），室溫下保存。2.1.5mol/LTris·HCl（pH8.8）Tris(MW121.14)18.171g蒸餾水100ml溶解后，（用濃鹽酸調(diào)pH至8.8），室溫下保存。3.10％SDSSDS10g蒸餾水至100ml如溶解困難，可在50℃水浴下溶解，室溫保存。如在長期保存中出現(xiàn)沉淀，水浴溶化后，仍可使用。1.10％過硫酸
5、胺（AP）過硫酸胺0.1g蒸餾水1ml（現(xiàn)用現(xiàn)配，可先將過硫酸胺干粉稱好分量后放在1.5mlEP管中，一次性多裝幾管，使用時加入蒸餾水水即可，溶解后，4℃保存，保存時間為1周）5．四甲基乙二胺原液（TEMED）：4°C保存。6．30%丙稀酰胺：4°C保存。10%下層膠（兩塊膠，15ml）：依次加入去離子水5.9ml30%丙烯酰胺5ml1.5MTris-HCl（pH8.8）3.8ml10%SDS150μl10%AP150μlTEMED6μl每加一種成分隨即搖勻，為了加快凝膠，可以將過硫酸胺和TEMED量加大，根據(jù)實驗當時的溫度適當調(diào)整，加入TEMED混
6、勻后應即刻灌膠。灌膠后加正丁醇（1ml）消泡5%上層膠（兩塊膠，6ml）：依次加入去離子水4.1ml30%丙烯酰胺1ml1MTris-HCl（pH6.8）0.75ml10%SDS60μl10%AP60μlTEMED6μl每加一種成分隨即搖勻，為了加快凝膠，可以將過硫酸胺和TEMED量加大，根據(jù)實驗當時的溫度適當調(diào)整，加入TEMED混勻后應即刻灌膠。7．5X電泳液緩沖液Tris（MW121.14）15.1g甘氨酸（MW75.07）94gSDS5.00g蒸餾水至1000ml溶解后室溫保存,用時稀釋5倍，通常取160ml配制成800ml即可。5．10X轉膜
7、緩沖液甘氨酸（MW75.07）151.1gTris（MW121.14）30.3g蒸餾水至1000ml溶解后室溫保存,用時稀釋10倍，并加入甲醇至20%。通常取80ml母液，加560ml蒸餾水，最加160ml甲醇，配制成800ml即可。（先加甲醇易產(chǎn)生沉淀）6．10XTBS緩沖液Tris（MW121.14）24.2gNaCl80.0g蒸餾水至1000ml（濃鹽酸調(diào)pH至7.6），溶解后室溫保存。10．1XTBST緩沖液10XTBS緩沖液100ml蒸餾水900mlTween-201ml因Tween-20比較粘稠，應緩慢吸取并可把槍頭剪掉一塊，即可防止產(chǎn)生
8、氣泡。溶解后室溫保存。11．封閉液/抗體稀釋液（5%脫脂牛奶)：1XTBST緩沖液95-100ml脫脂奶粉5
