細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查

《細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。

細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查一、倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)（一）一般的形態(tài)學(xué)觀察：（二）用相差顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)（三）熒光顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)

1

2IdentificationofculturedadultratRGCs.Culturedcellswereco-labeledwithanti-Thy-1antibody(A),anti-NF-Lantibody(B),andDAPI(C).(D)Adigitallymergedimagesimultaneouslyrepresentsallthreefluorescentlabels.(E)Thecorrespondingphase-contrastimage.

3免疫熒光染色法用于標(biāo)記二抗體的熒光素：（1）異硫氰酸熒光素（FITC）發(fā)射的熒光波長(zhǎng)為490～619（綠色熒光）（2）四乙基羅丹明：熒光波長(zhǎng)為540～660（橙紅色熒光）（3）DAPI或Hoechst33258:染核，用紫外激發(fā)

4免疫熒光的染色步驟1、用95%乙醇固定細(xì)胞10-30分或用冷丙酮固定5～10分。2、用PBS洗3次。3、用PBS配制的1‰Triton10分。用PBS洗3次4、用2%～5%BSA封閉2小時(shí)5、加入一抗過夜，PBS洗3次6、加入二抗1～2小時(shí)，PBS洗3次7、核復(fù)染，熒光顯微鏡觀察。

5正常細(xì)胞和組織的培養(yǎng)一、上皮細(xì)胞培養(yǎng)(epithelialculture)上皮細(xì)胞包括腺上皮是很多器官如肝、胰、乳腺等的功能成分，又由于癌起源于上皮組織，故上皮細(xì)胞培養(yǎng)特別受到重視。但上皮細(xì)胞培養(yǎng)中?；祀s有成纖維細(xì)胞，培養(yǎng)時(shí)生長(zhǎng)速度往往超過上皮細(xì)胞，并難以純化，同時(shí)上皮細(xì)胞難以在體外長(zhǎng)期生存，因此純化和延長(zhǎng)生存時(shí)間是培養(yǎng)關(guān)鍵。

6體內(nèi)上皮細(xì)胞生長(zhǎng)在膠原構(gòu)成的基膜，因此培養(yǎng)在有膠原的底物上可能利于生長(zhǎng)，另外人或小鼠表皮細(xì)胞培養(yǎng)在以3T3細(xì)胞為飼養(yǎng)層（用射線照射后）時(shí)，細(xì)胞易生長(zhǎng)并可發(fā)生一定程度的分化現(xiàn)象。降低PH、Ca2+含量和溫度，向培養(yǎng)基中加入表皮生長(zhǎng)因子，均有利于表皮細(xì)胞生長(zhǎng)。

7表皮細(xì)胞培養(yǎng)1、取材：外科植皮或手術(shù)殘余皮膚小塊，早產(chǎn)流產(chǎn)兒皮膚更好，取角化層薄者，切成0.5－1平方厘米小塊。2、置0.02%EDTA中，室溫，5分鐘。3、換入0.25%胰蛋白酶中，4℃過夜。4、分離：取出皮塊，用血管鉗或鑷子將表皮與真皮層分開。5、取出表皮，剪成更小的塊后，置0.25%胰酶中，37℃，30—60分鐘。6、反復(fù)吹打，制成懸液。7、培養(yǎng)：用80目不銹鋼紗網(wǎng)濾過后，低速離心，吸去上清。8、直接加入培養(yǎng)基（Eagle加20%小牛血清）制成細(xì)胞懸液，接種入培養(yǎng)瓶，CO2溫箱培養(yǎng)。

8

9CulturedMouseMammaryEpithelialCells

10神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞（神經(jīng)元〕不易培養(yǎng)，只有在適宜情況下，如接種在膠原底層上，或加入神經(jīng)生長(zhǎng)因子和膠質(zhì)細(xì)胞因子時(shí)，可出現(xiàn)一定程度的分化，長(zhǎng)出突起等現(xiàn)象，但很難使之增值。而神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)組織中比較容易培養(yǎng)的成分。人、鼠等腦組織即可用于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)，不僅能獲得生長(zhǎng)的膠質(zhì)細(xì)胞，也可形成能傳代的二倍體細(xì)胞系。一般說來，膠質(zhì)細(xì)胞在培養(yǎng)中生長(zhǎng)不穩(wěn)定，不易自發(fā)轉(zhuǎn)化，但對(duì)外界因素仍保持很好的敏感性，

11獲取腦組織后，仔細(xì)剝除腦膜、血管和纖維成分，置Hanks液中漂洗一、二次。2、置于30—50倍體積的Hanks液中，此時(shí)腦組織比較柔軟，反復(fù)吹打即制成細(xì)胞懸液。3、把懸液注入離心管室溫中直立5—10分鐘后，細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)快自然下沉，脂肪等雜物易漂浮，可吸除上層、反復(fù)二、三次，即可排除脂肪成分和其它碎塊并獲較多細(xì)胞成分。4、在沉降物中加入適量培養(yǎng)液，通過紗網(wǎng)過濾，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度。5、接入培養(yǎng)瓶或皿中，置5%CO2溫箱中培養(yǎng)。該細(xì)胞適應(yīng)環(huán)境過程較長(zhǎng)，接種后貼壁較慢。貼壁后短期內(nèi)也可能不見細(xì)胞分裂現(xiàn)象，然而一旦生長(zhǎng)后即能迅速進(jìn)入旺盛的增殖狀態(tài)。細(xì)胞傳代可以0.25%胰酶消化處理。

12Culturedneuron

13Culturedmicroglia

14大鼠肝細(xì)胞的培養(yǎng)(成年)培養(yǎng)液:Koga培養(yǎng)液,最好加入Williams和WaymouthMB752/1)消化液:??型膠原酶300U/mg,使用濃度為0.025%方法:1灌流法分離肝細(xì)胞：門靜脈和下腔插管靜脈插管2、用預(yù)灌流液(8.3mg/mlNaCl,0.5mg/mlKCl,2.4mg/mlHEPES,pH7.4)灌流8分鐘

153、用含0.05%膠原酶的灌流液(預(yù)灌流液中加入5mmol/LCaCl2,0.05%膠原酶)繼續(xù)灌流10分鐘。4、將肝葉剪下,將消化好的肝細(xì)胞輕輕刮下,獲得的肝細(xì)胞懸液離心(600r/min)三次,每次2分鐘5、然后重新懸浮于WE培養(yǎng)基中(含10%血清,Insulin0.2U/ml,L-Glutamine0.292mg/ml，100nMdexamethasone)。6、IsolatedcellswereplatedoncollagentypeI-coateddishesinmediumIconsistingofWilliams‘mediumE。

16HepatocyteIsolationandCultureHepatocyteswereisolatedfromtheliveroffedmaleBALB/cmice(22-25g)byusingthetwo-stepcollagenaseperfusionmethod.Aftertheinductionofanesthesiawithpentobarbitalsodium(400mg/kgip),theperitonealcavitywasopened,andtheliverwasperfusedinsituviatheportalveinfor4minat37°Cwithcalcium-freeHEPESbufferandfor7minwithHEPESbuffercontaining45mg/100mlcollagenaseD(Boehringer-Mannheim,Laval,QC,Canada)and135mg/100mlCaCl2.Theperfusionratewassetat5ml/minforbothsolutions.

17Thecellswereusedonlyifcellviability,asdeterminedbytrypanblueexclusion,was>80%.Thecellswereseededontoplasticpetridishes(26,000cells/cm2)inWilliams'mediumE(GIBCOBRL,Toronto,ON,Canada)supplementedwith10%fetalbovineserum(GIBCOBRL)andallowed90mintoattach.Theserum-containingmediumwasthenremoved,andthecellsweresubjectedtodifferentcultureconditionsinserum-freemedium.

18Fig.5.MorphologyofEGF-treatedmousehepatocytesinthepresenceandabsenceofPD-168393.Primarymousehepatocytecultureswereincubatedwithmedium(untreated)orEGF(50ng/ml)inthepresenceorabsenceof10?μMPD-168393.After24?hinculture,EGF-treatedhepatocyteswerespread,andtheircellsurfaceincreasedcomparedwithuntreatedcells.HepatocytestreatedwithEGFinthepresenceofPD-168393werespheroidandresembledcontrolcellswithorwithoutPD-168393.Magnification,×100.

19大鼠心肌細(xì)胞的培養(yǎng)新生大鼠鼠齡的選擇新生大鼠心肌細(xì)胞在出生后3d內(nèi)具有部分的增殖能力,成年大鼠心肌細(xì)胞則為終末分化細(xì)胞,不再具有分裂增殖能力.因此,大鼠出生時(shí)間越短,其心肌細(xì)胞分離后成活率越高,越容易貼壁生長(zhǎng).大量觀測(cè)表明,選擇13d齡大鼠分離其心肌細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)較為理想.其中尤以半日齡大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)效果最佳.

20神經(jīng)細(xì)胞分散培養(yǎng)（一）選材常用胚胎動(dòng)物或新生鼠神經(jīng)組織。雞胚常用胚齡6-8d，新生鼠或胎鼠（12-14d）或人胚胎。不過也有認(rèn)為與組織相關(guān)。如大白鼠胚胎以19d為宜，小鼠以18d為宜，大鼠紋狀體以10d為宜；若紋狀體與黑質(zhì)聯(lián)合培養(yǎng)的大鼠胚，則黑質(zhì)以13d，紋狀體18-21d為宜；小腦以20-21d小鼠胚胎，所獲蒲氏細(xì)胞成活率高，顆粒細(xì)胞正在分化；脊髓與DRG聯(lián)合培養(yǎng)，常用4-7d雞胚或12-14d小鼠胚胎，取材易，神經(jīng)成活率高。

21(二）取材。腦則取出相應(yīng)組織，在解剖液中先剪碎，以使胰酶消化。脊髓則固定于瓊脂板上，用小刀將其要成背腹兩側(cè)，分別培養(yǎng)。（三）細(xì)胞分離與接種。神經(jīng)組織用0.125-0.25%胰蛋白酶在37℃孵育30min，移入接種液，停止消化，并洗去胰蛋白酶液，用細(xì)口吸管吹打細(xì)胞懸液，使其充分分散，如此多次，待沉淀后吸出上層細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，預(yù)置細(xì)胞密度，接種于培養(yǎng)皿（1×106），做電生理應(yīng)為5×105或更低。

22（四）抑制膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)。培養(yǎng)3-5d后，也有人認(rèn)為培養(yǎng)7d后，用阿糖胞苷，或5-FU抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)。（五）觀察。接種6-12h，開始貼壁，并有集合現(xiàn)象，細(xì)胞生長(zhǎng)突起明顯，5-7d膠質(zhì)細(xì)胞增生明顯，7-10d膠質(zhì)細(xì)胞成片于神經(jīng)細(xì)胞下面，形成地毯，2周時(shí)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)最豐滿，四周暈光明顯，一個(gè)月后，有些神經(jīng)細(xì)胞開始退化，變形，甚至出現(xiàn)空泡，一般培養(yǎng)2-4周最宜。

23但神經(jīng)細(xì)胞只能增大，而不能增殖，只能原代，不能傳代，不會(huì)有細(xì)胞周期，而且隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞數(shù)量在下降，但膠質(zhì)細(xì)胞可以，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞也可以。在培養(yǎng)過程中，早期9-12d時(shí)，有較多的神經(jīng)細(xì)胞死亡，這是第一次死亡階段，應(yīng)注意保持條件的恒定。在此之后存活下去的細(xì)胞一般突起長(zhǎng)而多，且相互形成突觸。

24Neuronalculture1.Ratpupsagedl-l5d,werekilledbycervicaldislocation.2.CortexplacedinEarle’sbalancedsaltsolution(BSS)at37°C.andcutinto500urnslices3.Slicesofvisualcortexwereincubatedat37°Cwithgentlestirringin10mlofenzymesolution4.After1.5hr.thesliceswererinsedbrieflywithEarle’sBSScontainingBSA,1mg/ml.5.Theslicesweregentlytrituratedwithafire-polishedPasteurpipetin2-3mlofthissolution.

25FreshlydissociatedcellsthatexcludedthedveErythrosinB(Phillips,1973)wereconsideredtobeviable.Dissociatedcellswereharvestedbylow-speedcentrifugation(10min,70xg)through5mlofEarle’sBSScontainingBSA(10mg/ml).Cellswereresuspendedingrowthmediumandplatedinmodifiedpetridishes.Typically,cellsfromasingleratpupwereusedtoprepare40-50culturedishes.Optimalviabilityandmorphologicalpreservationofthedissociatedcellswereobtainedusingtheenzymepapain.

26血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)取材人和動(dòng)脈不同部位、不同血管如大動(dòng)脈與小動(dòng)脈、毛細(xì)血管，以及靜脈血管之間存在差異，在處理這些細(xì)胞時(shí)應(yīng)分別對(duì)待。血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)較小，近似圓形，呈均勻排列，一般取材于人和動(dòng)物的臍帶。

27人大動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)人大動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞可來自手術(shù)、病理活檢組織，也可來自尸體（需在死后24h內(nèi)取材)方法:(1)小心剝除已游離的大血管外膜，置于盛有冷的磷酸鹽平衡鹽溶液平皿中反復(fù)漂洗，洗凈血管內(nèi)、外面的血液和脂質(zhì)。（2）剪開血管，放入37℃消化液中，60min，消化結(jié)合后，用23號(hào)針頭注射器吸取消化液沖洗血管內(nèi)腔，（3）收集消化液置無菌試管中，離心（1000rpm7min）棄上清，加入含血清培養(yǎng)基中，使細(xì)胞重新懸并調(diào)整細(xì)胞數(shù)。（4）接種于相應(yīng)大小培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中，37℃恒溫溫箱培養(yǎng)，一周后內(nèi)皮細(xì)胞可長(zhǎng)成單層，呈多角形鋪成石狀排列。

28注意事項(xiàng)：①如果小于23號(hào)針頭則回收內(nèi)皮細(xì)胞效果差，若針頭過大則注射器內(nèi)壓大會(huì)吸入緊貼內(nèi)皮細(xì)胞的平滑肌細(xì)胞，因此注意使用恰當(dāng)?shù)尼橆^；②人血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)條件要求高，是依賴于生長(zhǎng)因子的一種細(xì)胞。常用的培養(yǎng)基為RPMI1640，培養(yǎng)時(shí)添加15%FBS，15%Nu-Serum，5～20μg/ml的內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（ECGF）以及100μg/ml的肝素。改進(jìn)的培養(yǎng)基有MCDB109培養(yǎng)基，市場(chǎng)上也有內(nèi)皮細(xì)胞商品培養(yǎng)基，可根據(jù)需要選擇購買；③培養(yǎng)基中必須加入相應(yīng)抗生素，最終濃度：慶大霉素為15μg/ml，氨芐青霉素為50μg/ml，二性霉素B1～2μg/ml，二甲胺四環(huán)素1μg/ml。在48h內(nèi)可以防止細(xì)胞感染，3日后還應(yīng)添加慶大毒素。

29臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)在嬰兒出生時(shí)立即將臍帶放置于無菌的500ml磷酸鹽溶液（PBS）中低溫保存。次日分離細(xì)胞。臍帶有一根靜脈兩根動(dòng)脈，通常用內(nèi)腔大靜脈。將洗凈的靜脈一端用夾子夾緊，一端注入消化液，靜置孵育片刻。然后PBS或培養(yǎng)液反復(fù)抽吸內(nèi)腔，收集后與消化液一并離心、沉淀內(nèi)皮細(xì)胞。所用培養(yǎng)基與大動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基相同，臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、大動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞易于培養(yǎng)，既使不加生長(zhǎng)因子在最初幾代細(xì)胞也會(huì)增殖良好。

30血管內(nèi)皮細(xì)胞重要標(biāo)志（1）第Ⅷ因子關(guān)連抗原（vonwillebrandfactor,VWF），可以由全身所有血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生，檢測(cè)這一因子主要用相應(yīng)抗體。VWF有其特異性，人的VWF抗體對(duì)牛的內(nèi)皮細(xì)胞沒有交叉反應(yīng)。兔疫熒光間接法測(cè)定該因子，陽性細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)長(zhǎng)的熒光顆粒，在核周圍的顆粒較密，細(xì)胞邊緣顆粒較少。（2）Weibel-Palade小體，該小體是血管內(nèi)皮細(xì)胞又一特異性的標(biāo)志。電子顯微鏡下，呈現(xiàn)0.1～0.3μm,長(zhǎng)0.5～5μm的橢圓形棒狀結(jié)構(gòu)。上述的VWF就是該小體產(chǎn)生的。

31

32血管平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng)血管平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)常用的方法有貼塊法（explant）和酶解離法（enzymedisperse）。貼塊法具有獲得平滑肌細(xì)胞純度高，量多，操作簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)。但用貼塊法易使平滑肌細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)肌絲喪失，亞細(xì)胞器增加。相反，酶解離法，由于酶的作用使細(xì)胞間失去連接，細(xì)胞內(nèi)肌絲含量豐富，保持收縮型狀態(tài)。培養(yǎng)平滑肌細(xì)胞常取材于兔、豬、鼠、猴的胸腹主動(dòng)脈段。

331．貼塊法方法：動(dòng)物經(jīng)頸動(dòng)脈放血后，在無菌操作下迅速取出胸腹主動(dòng)脈段，置于含Hank's液的平皿中漂洗3次，將凝塊洗干凈后剝除外膜的纖維脂肪層，然后縱行切開血管，刮除內(nèi)膜即內(nèi)皮細(xì)胞迅速撕下中膜內(nèi)、中層，切成約1mm寬的小條，浸泡在含血清的Hank's液中，并將撕下小組織塊種植于培養(yǎng)瓶壁。置于37℃恒溫箱，2h左右，取出培養(yǎng)瓶加入20%胎牛血清的培養(yǎng)液，再放回培養(yǎng)箱內(nèi)靜止培養(yǎng)4天。4天后可見細(xì)胞從組織中遷移游出。

34培養(yǎng)時(shí)注意事項(xiàng)為了保證培養(yǎng)的成功，應(yīng)注意：①種植組織塊的數(shù)目，如75cm2的長(zhǎng)頸瓶組織塊不得少于30個(gè)；②根據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞的種屬加入適量的不同血清，一般可加入牛血清，若小牛血清增殖效果差，應(yīng)加胎牛血清（FBS），通常濃度為10%～20%；③培養(yǎng)基的選擇：常用的有DMEM（Dulbecco'smodifiedEagles'medium），M199培養(yǎng)基。培養(yǎng)兔的平滑肌細(xì)胞用DMEM效果較好。

352．酶解離法沿動(dòng)脈縱軸切開后，刮除內(nèi)皮細(xì)胞撕下中膜的內(nèi)2/3，注意不要混入內(nèi)皮細(xì)胞，將組織塊切成1-2mm2，放入加有3mg/ml膠原酶的無血清M199培養(yǎng)基中，37℃，0.5～1.5h。離心去上清，重復(fù)上述消化步驟，然后再離心（9000r,4min），收集細(xì)胞，在5%～10%同種血清或胎牛血清的M199培養(yǎng)基中調(diào)整細(xì)胞數(shù)，然后轉(zhuǎn)入30～90mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，對(duì)于兔子應(yīng)加入高濃度的谷氨酰胺（0.2g/L）較佳。不同研究者在培養(yǎng)基、酶濃度以及消化時(shí)間等的選擇都有很大的差異。

36動(dòng)脈平滑肌的特性由于貼塊法和解離法處理方式不同，在細(xì)胞培養(yǎng)的最初階段細(xì)胞形態(tài)和性質(zhì)存在差異。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，培養(yǎng)環(huán)境趨于一致，細(xì)胞特性上也趨于近似。光學(xué)倒置顯微鏡下觀察：原代平滑肌細(xì)胞形狀多樣，一般常為梭形、帶形、三角形或星形。貼塊法培養(yǎng)，細(xì)胞可于2周后長(zhǎng)成單層；而酶解離只需6～7天，鏡下可見明顯“峰-谷”樣生長(zhǎng)。

37牙髓細(xì)胞的培養(yǎng)培養(yǎng)用液：PBSA；膠原酶：I型，用D－Hank’s液配制，625U/ml；培養(yǎng)液：DMEM＋10％FBS；Protocol：取拔除的正畸牙或阻生牙（年齡小者較佳），盡量完整的取出牙髓，置于培養(yǎng)皿中，用PBS沖洗；將牙髓放入離心管，加入膠原酶2－3ml/牙，37℃，2－3小時(shí)（原則是將牙髓消化徹底）；加入等量培養(yǎng)液，吹打至單細(xì)胞，離心，重懸，接種，牙/6well；

38牙周細(xì)胞的培養(yǎng)培養(yǎng)用液：PBSA；膠原酶：I型，用D－Hank’s液配制，625U/ml；培養(yǎng)液：DMEM＋10％FBS；Protocol：取拔除的正畸牙或阻生牙（年齡小者較佳），置于培養(yǎng)皿中，用手術(shù)刀仔細(xì)刮除附著在牙根上的牙齦組織，然后用PBS反復(fù)沖洗，以去除殘余組織以及牙根表面的血細(xì)胞；將牙放入離心管，加入膠原酶2－3ml/牙，37℃，1小時(shí)；加入等量培養(yǎng)液，仔細(xì)吹打牙根表面，收集細(xì)胞，離心，重懸，接種，牙/6well；*培養(yǎng)獲得的細(xì)胞是牙周膜細(xì)胞和成牙骨質(zhì)細(xì)胞的混合體!

39年齡對(duì)細(xì)胞產(chǎn)量以及活力影響較大，最好選用年齡在10－14歲之間的正畸牙或阻生牙；如果選用大鼠牙齒作為培養(yǎng)目標(biāo)，培養(yǎng)液應(yīng)稍作調(diào)整，基本原則是抑制細(xì)胞的衰老，具體做法是：適當(dāng)降低血清濃度（選用進(jìn)口血清最佳），如果降低血清濃度后，細(xì)胞增殖減慢，可加入促進(jìn)細(xì)胞增殖的因子（例如BPE25ug/ml等）。

40巨噬細(xì)胞培養(yǎng)巨噬細(xì)胞屬免疫細(xì)胞，有多種功能，是研究細(xì)胞吞噬、細(xì)胞免疫和分子免疫學(xué)的重要對(duì)象。巨噬細(xì)胞屬不繁殖細(xì)胞群，在條件適宜下可生活2－3周，多用做原代培養(yǎng)，難以長(zhǎng)期生存。培養(yǎng)巨噬細(xì)胞可用各樣方法和各種來源來獲取細(xì)胞，以小鼠腹腔取材法最為實(shí)用，其法如下：1、實(shí)驗(yàn)前三天，向小鼠腹腔內(nèi)注入無菌硫羥乙酸肉湯lml（勿注入腸內(nèi)?。?，2、引頸處死小鼠。3、手提鼠尾將其全浸入70%乙醇中3－5秒。4、置動(dòng)物于解剖臺(tái)，用針頭固定四肢，持鑷撕開腹部皮膚，但勿傷及腹膜壁，把皮膚拉向上下兩側(cè)，暴露出腹膜壁。

415、用70%酒精擦洗腹膜壁，注射器吸10mlEagle液注入腹腔中，同時(shí)用手指從兩側(cè)壓揉腹膜壁，使液體在腹腔內(nèi)流動(dòng)。6、用針頭輕挑起腹壁并微傾向一側(cè)．使腹腔中液體集中于針頭下吸取入針管內(nèi)。7、小心拔出針頭，把液體注入離心管。8、4℃下250g離心10分鐘后，去上清，加10mlEagle培養(yǎng)基。9、計(jì)數(shù)細(xì)胞。每只鼠可產(chǎn)生20一30×106細(xì)胞，其中90%為巨噬細(xì)胞。10、以3×105個(gè)貼附細(xì)胞/平方厘米接種。11、接種數(shù)小時(shí)后，除去培養(yǎng)液，可去除其它白細(xì)胞，純化培養(yǎng)細(xì)胞，用Eagle液沖洗1一2次，再加新Eagle培養(yǎng)液置CO2溫箱中。

42干細(xì)胞（stemcells)的培養(yǎng)概念：來自胚胎、胎兒或成體未分化的具有無限或長(zhǎng)期自我維持和自我更新能力的細(xì)胞性質(zhì)：能自我更新能產(chǎn)生許多分化的后裔分類：根據(jù)組織來源：（1）胚胎干細(xì)胞（embryonicstemcell,ES)（2）成體干細(xì)胞（adultstemcell,AS)

43胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞（ES）是指來自胚胎期桑椹胚的卵裂球或胚泡的內(nèi)細(xì)胞團(tuán).胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)的主要問題是保持干細(xì)胞于為分化狀態(tài)。通常是將胚胎干細(xì)胞種植在鋪有一層經(jīng)絲裂霉素C處理的成纖維細(xì)胞（飼細(xì)胞）上或在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入白血病細(xì)胞生長(zhǎng)抑制因子（LIF）以防止ES細(xì)胞分化。

44ES的生物學(xué)特性ES細(xì)胞在體外分化抑制培養(yǎng)基中呈克隆狀生長(zhǎng)，細(xì)胞緊密地聚集在一起，形式鳥巢，細(xì)胞界限不清，克隆周圍可見有單個(gè)的ES細(xì)胞和分化的扁平狀上皮細(xì)胞。ES細(xì)胞為正常的二倍體細(xì)胞，胞體體積大，胞質(zhì)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單。能檢測(cè)到早期胚胎細(xì)胞中表達(dá)的階段特異性胚胎抗原。

45

46小鼠胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)（一）材料1、將配種后3.5天小鼠斷頸后處死,剪開腹腔取出子宮角,沖胚液沖洗后,收集胚胎.2培養(yǎng)液：ES培養(yǎng)液DMEM培養(yǎng)液（高糖）3飼養(yǎng)層細(xì)胞（二）方法1、將小鼠囊胚隨機(jī)放入鋪有飼養(yǎng)層細(xì)胞的4孔培養(yǎng)板上，每孔一枚，加入5mlES培養(yǎng)液培養(yǎng)

472、培養(yǎng)24、48、72小時(shí)分別記錄胚胎貼壁細(xì)胞的生長(zhǎng)行為，48小時(shí)后可見ICM迅速生長(zhǎng)。3、4～5天后，ICM長(zhǎng)成一簇簇的細(xì)胞團(tuán)且未有分化現(xiàn)象，形似鳥巢狀的小鼠細(xì)胞團(tuán)衍生物。用無菌玻璃針撥動(dòng)，使其與滋養(yǎng)層細(xì)胞分開，將細(xì)胞用胰酶消化成單個(gè)細(xì)胞。4、將細(xì)胞重新接種在鋪有飼養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)板。

48干細(xì)胞系的培養(yǎng)步驟：1．從液氮中取出一管細(xì)胞；2．將凍存管置于37℃水浴中2分鐘（或放到管內(nèi)溶液恰好完全溶解）；3．將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到一15mlFalcon管中；4．加入5mlES培養(yǎng)基（用培養(yǎng)基沖洗凍存管）；5．離心3分鐘；6．棄上清，用2mlES培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，至少吹打10次；7．接種在明膠包被（見下文）的6孔或6cm組織培養(yǎng)皿；8．孵育。

49細(xì)胞傳代建議每2天傳代細(xì)胞一次，過度生長(zhǎng)的細(xì)胞會(huì)降低細(xì)胞的自然分化率，我們建立了一種純化方法來去除分化細(xì)胞，在將細(xì)胞接種在明膠包被的培養(yǎng)板上之前，通過將分化細(xì)胞黏附在沒有包被的組織培養(yǎng)板上去除分化細(xì)胞。純化步驟包含在下面的方法中。1．去除培養(yǎng)液；2．無鈣鎂PBS（Gibco）洗滌；3．加入胰酶EDTA（Gibco）。37℃孵育5分鐘。4．加入ES培養(yǎng)基使胰酶失活；5．將細(xì)胞轉(zhuǎn)入15ml離心管中離心3min；6．去除上清，將細(xì)胞重懸于2mlES培養(yǎng)基，至少吹打10－20次。

50如果加入培養(yǎng)基的量較少會(huì)比較容易將細(xì)胞團(tuán)弄散分開。ES細(xì)胞有聚集成團(tuán)的傾向，傳代過程中仔細(xì)將細(xì)胞弄散分開很重要。這樣可能會(huì)減少細(xì)胞的自然分化。7．將細(xì)胞接種在沒有包被的組織培養(yǎng)皿中（使用和一開始同樣規(guī)格的培養(yǎng)皿）放入溫箱2小時(shí)（分化細(xì)胞在該時(shí)間內(nèi)將黏附，而ES細(xì)胞仍將保持懸?。?．將含有細(xì)胞的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入geltin包被的組織培養(yǎng)皿。吹打以確保細(xì)胞被分散開（前面已經(jīng)提到--ES細(xì)胞有聚集成團(tuán)的傾向）9．建議按1：4－1：10的比率傳代(ATCC)保持細(xì)胞的傳代比率很重要，以我們的經(jīng)驗(yàn)，1：8的比率是好的，可以使細(xì)胞的自然分化降到最低。當(dāng)你使用不同規(guī)格的培養(yǎng)板進(jìn)行細(xì)胞傳代可以使用表1來計(jì)算傳代比率。

51成體干細(xì)胞培養(yǎng)①原代細(xì)胞的培養(yǎng):將剛出生的SD大鼠用75%酒精消毒后,頸椎脫臼處死,放入高壓滅菌的培養(yǎng)皿中,于解剖顯微鏡下分離出全腦,剝離腦膜和血管,收集腦室下區(qū)的組織,放入D-Hank’s液中漂洗兩次。將分離的腦室下區(qū)組織放入4℃基礎(chǔ)培養(yǎng)液中,剪切成0.5mm3的小塊,加入0.25%的trysine在37℃下震蕩消化20～30min。離心、棄上清,再用基礎(chǔ)培養(yǎng)液清洗兩次。然后,經(jīng)高壓消毒的40μm不銹鋼網(wǎng)過濾,用滴管輕輕地吹打制成單細(xì)胞懸液,計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞的密度。以

52接種于預(yù)先置有Poly-L-lysine的24孔和6孔培養(yǎng)板(costar)中。培養(yǎng)液為含有10%FCS的DMEM/F12(1∶1)。培養(yǎng)24h以后,將培養(yǎng)液換成無血清的完全培養(yǎng)液(DMEM/F12加N2、bFGF10μg/L、EGF20μg/L、heparin4×104U/L、青霉素1×105U/L及鏈霉素1×106U/L),于37℃、5%CO2條件下靜置培養(yǎng)7d,每隔2d半量換液1次。②傳代培養(yǎng):將原代培養(yǎng)7d后的貼壁細(xì)胞及在貼壁細(xì)胞上形成的細(xì)胞球,經(jīng)吹打收集于離心管中。離心、棄上清,以滴管輕輕吹打后,用完全培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液,進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色并計(jì)數(shù)。以2×105個(gè)細(xì)胞接種于75mL(NUNC)和6孔培養(yǎng)板中,在37℃、5%CO2條件下靜置培養(yǎng)7d,每隔2d半量換液1次。此后,每隔7d傳代1次,在顯微鏡下用滴管將形成的克隆球輕輕打成45瓣進(jìn)行傳代。

53②傳代培養(yǎng):將原代培養(yǎng)7d后的貼壁細(xì)胞及在貼壁細(xì)胞上形成的細(xì)胞球,經(jīng)吹打收集于離心管中。離心、棄上清,以滴管輕輕吹打后,用完全培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液,進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色并計(jì)數(shù)。以2×105個(gè)細(xì)胞接種于75mL(NUNC)和6孔培養(yǎng)板中,在37℃、5%CO2條件下靜置培養(yǎng)7d,每隔2d半量換液1次。此后,每隔7d傳代1次,在顯微鏡下用滴管將形成的克隆球輕輕打成45瓣進(jìn)行傳代。

54傳代培養(yǎng)7天的克隆細(xì)胞球

55腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞在組織培養(yǎng)中占有核心的位置，首先癌細(xì)胞是比較容易培養(yǎng)的細(xì)胞。當(dāng)前建立的細(xì)胞系中癌細(xì)胞系是最多的。另外腫瘤對(duì)人類是威脅最大的疾病。腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)是研究癌變機(jī)理、抗癌藥檢測(cè)、癌分子生物學(xué)極其重要的手段。腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)闡明和解決癌癥將起著不可估量的作用

56組織培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性腫瘤細(xì)胞與體內(nèi)正常細(xì)胞相比，不論在體內(nèi)或在體外，在形態(tài)、生長(zhǎng)增值、遺傳性狀等方面都有顯著的不同。生長(zhǎng)在體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞和在體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞，其差異較小，但也并非完全相同。培養(yǎng)中的腫瘤細(xì)胞具以下突出特點(diǎn)：

57（－）形態(tài)和性狀培養(yǎng)中癌細(xì)胞無光學(xué)顯微鏡下特異形態(tài)，大多數(shù)腫瘤細(xì)胞鏡下觀察比二倍體細(xì)胞清晰，核膜、核仁輪廓明顯，核糖體顆粒豐富。電鏡觀察癌細(xì)胞表面的微絨毛多而細(xì)密，微絲走行不如正常細(xì)胞規(guī)則，可能與腫瘤細(xì)胞具有不定向運(yùn)動(dòng)和錨著不依賴性有關(guān)

58（二）生長(zhǎng)增殖腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)具有不受控增殖性，在體外培養(yǎng)中仍如此。正常二倍體細(xì)胞在體外培養(yǎng)中不加血清不能增殖，是因血清中含有很細(xì)胞增殖生長(zhǎng)的因子，而癌細(xì)胞在低血清中（2％～5％）仍能生長(zhǎng)。已證明腫瘤細(xì)胞有自泌或內(nèi)泌性產(chǎn)生促增殖因子能力。正常細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化后，出現(xiàn)能在低血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的現(xiàn)象，已成為檢測(cè)細(xì)胞惡變的一個(gè)指標(biāo)。癌細(xì)胞或培養(yǎng)中發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化后的單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，形成集落（克隆）的能力比正常細(xì)胞強(qiáng)。另外癌細(xì)胞增殖數(shù)量增多擴(kuò)展時(shí)，接觸抑制消除，細(xì)胞能相互重疊向三維空間發(fā)展，形成堆積物。

59（三）永生性永生性也稱不死性。在體外培養(yǎng)中表現(xiàn)為細(xì)胞可無限傳代而不凋亡（Apoptosis）。體外培養(yǎng)中的腫瘤細(xì)胞系或細(xì)胞株都表現(xiàn)有這種性狀，從近年建立細(xì)胞系或株的過程說明，如果永生性是體內(nèi)腫瘤細(xì)胞所固有的，腫瘤細(xì)胞應(yīng)易于培養(yǎng)。事實(shí)上，多數(shù)腫瘤細(xì)胞初代培養(yǎng)時(shí)并不那么容易。生長(zhǎng)增殖并不旺盛；經(jīng)過純化成單一化瘤細(xì)胞后，也大多增殖若干代后，便出現(xiàn)類似二倍體細(xì)胞培養(yǎng)中的停滯期。過此階段后才獲得永生性，順利傳代生長(zhǎng)下去。從而說明體外腫瘤細(xì)胞的永生性有可能是體外培養(yǎng)后獲得的。從一些具有永生性而無惡性性的細(xì)胞系，如NIH3T3、Rat－1、10T1/2等細(xì)胞證明，永生性和惡性（包括浸潤(rùn)性）是兩種性狀，受不同基因調(diào)控，但卻有相關(guān)性。可能永生性是細(xì)胞惡變的階段。至少在體外是如此。

60（四）浸潤(rùn)性浸潤(rùn)性是腫瘤細(xì)胞擴(kuò)張性增殖行為，培養(yǎng)癌細(xì)胞仍持有這種性狀。在與正常組織混合培養(yǎng)時(shí)，能浸潤(rùn)入其它組織細(xì)胞中，并有穿透人工隔膜生長(zhǎng)的能力。

61（五）異質(zhì)性所有腫瘤都是由有增殖能力、遺傳性、起源、周期狀態(tài)等性狀不同的細(xì)胞組成。異質(zhì)性構(gòu)成同一腫瘤內(nèi)細(xì)胞的活力有差別的瘤組織；處于瘤體周邊區(qū)的細(xì)胞獲得血液供應(yīng)多，增殖旺盛，中心區(qū)有的細(xì)胞衰老退化，有的處于周期阻滯狀態(tài)，那些呈活躍增殖狀態(tài)的細(xì)胞稱干細(xì)胞（StemCells）、只有這些干細(xì)胞才是支持腫瘤生長(zhǎng)的成分。腫瘤干細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)易于生長(zhǎng)增殖；把干細(xì)胞分離出來的培養(yǎng)方法稱干細(xì)胞培養(yǎng)。

62（六）細(xì)胞遺傳大多數(shù)腫瘤細(xì)胞有遺傳學(xué)改變，如失去二倍體核型、呈異倍體或多倍體等。腫瘤細(xì)胞群常由多個(gè)細(xì)胞群組成，有干細(xì)胞系和數(shù)個(gè)亞系，并不斷進(jìn)行著適應(yīng)性演變。

63腫瘤細(xì)胞在體外不易生長(zhǎng)的原因可能由于：①依賴性：腫瘤細(xì)胞雖有較強(qiáng)克隆生長(zhǎng)力，但仍有一定的群體性或與其它細(xì)胞相依存關(guān)系。一是腫瘤細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的相互依存，二是腫瘤細(xì)胞與基質(zhì)成纖維細(xì)胞的依賴。體外分散培養(yǎng)和排除成纖維細(xì)胞后也會(huì)同時(shí)消除或減弱這些依存關(guān)系，可能影響癌細(xì)胞增殖生長(zhǎng)的活性；

64②腫瘤細(xì)胞的自泌也會(huì)因分散培養(yǎng)而被稀釋，達(dá)不到腫瘤生長(zhǎng)的需求，降低腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖力；③并非所有腫瘤細(xì)胞都有強(qiáng)的生長(zhǎng)活力和長(zhǎng)的LifeSpan，只有干細(xì)胞才有強(qiáng)的增殖生長(zhǎng)能力，但這些細(xì)胞數(shù)量很少；④離體培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞可能需求與體內(nèi)相似的特殊生存條件。

65二、培養(yǎng)方法腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)成功關(guān)鍵在于：取材、成纖維細(xì)胞的排除、選用適宜的培養(yǎng)液和培養(yǎng)底物等幾個(gè)方面。在具體培養(yǎng)方法方面，腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)與正常組織細(xì)胞培養(yǎng)并無原則差別，初代培養(yǎng)應(yīng)用組織塊和消化培養(yǎng)法均可。

66腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)1．取材：人來自外科手術(shù)或活檢瘤組織。取材部位非常重要，體積較大的腫瘤組織中有退變或壞死區(qū)，取材時(shí)盡量避免用退變組織，要挑選活力較好的部位。癌性轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)或胸腹水是好的培養(yǎng)材料。取材后宜盡快進(jìn)行培養(yǎng)，如因故不能立即，可貯存于4℃中，但不宜栽過24小時(shí)。

672．培養(yǎng)基：腫瘤細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基的要求不如正常細(xì)胞嚴(yán)格，一般常用的RPMIl640、DMEM、Mc-Coy5A等培養(yǎng)基等皆可用于腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)。腫瘤細(xì)胞對(duì)血清的需求比正常細(xì)胞低，正常細(xì)胞培養(yǎng)不加血清不能生長(zhǎng)，腫瘤細(xì)胞在低血清培養(yǎng)基中也能生長(zhǎng)。腫瘤細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)環(huán)境適應(yīng)性較大，是因腫瘤細(xì)胞有自泌（Autocrine）性產(chǎn)生促生長(zhǎng)物質(zhì)之故。但這并不說明腫瘤細(xì)胞完全不需要這些成分。按不同細(xì)胞需要不同的生長(zhǎng)因子；腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞之間、腫瘤細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞之間對(duì)生長(zhǎng)因子的需求都存在著差異。但大多數(shù)腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)中仍需要生長(zhǎng)因子。有的還需特異性生長(zhǎng)因子〔如乳腺癌細(xì)胞等）?？傊囵B(yǎng)腫瘤細(xì)胞仍需加血清和相關(guān)生長(zhǎng)因子培養(yǎng)更易成功。

683．成纖維細(xì)胞的排除：成纖維細(xì)胞常與腫瘤細(xì)胞同時(shí)混雜生長(zhǎng)，致難以純化腫瘤細(xì)胞。而且成纖維細(xì)胞常比腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)得快，最終能壓制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。因此排除成纖維細(xì)胞成為腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)中的關(guān)鍵。排除成纖維細(xì)胞有多種方法（表2－1）。

69（二）成纖維細(xì)胞排除法1．機(jī)械刮除法：是用不銹鋼絲末端插有橡膠刮頭（用膠塞剪成三角形插以不銹鋼絲）、或裹少許脫脂棉制成，裝入試管中高壓滅菌后備用（也可用特制電熱燒灼器刮除）。刮除程序?yàn)椋?（1）標(biāo)記：鏡下觀察，用不脫色筆在培養(yǎng)瓶皿的背面圈下生長(zhǎng)腫瘤細(xì)胞的部位；（2）刮除：棄掉培養(yǎng)液，把無菌膠刮伸入瓶皿中，肉眼或顯微鏡窺視下，刮除無標(biāo)記空間；（3）用Hanks液沖洗一兩次，洗除被刮掉的細(xì)胞；（4）注入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，如發(fā)現(xiàn)仍有成纖維細(xì)胞殘留，可重復(fù)刮除至完全除掉為止

702．反復(fù)貼壁法：根據(jù)腫瘤細(xì)胞比成纖維細(xì)胞貼壁速度慢的特點(diǎn)，并結(jié)合使用不加血清的營(yíng)養(yǎng)液，把含有兩類細(xì)胞的細(xì)胞懸液反復(fù)貼壁，使兩類細(xì)胞相互分離，操作方法與傳代相同。（1）待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)一定數(shù)量后，倒出舊培養(yǎng)液，用胰酶消化后，Hanks沖洗2次，加入不含血清的培養(yǎng)液，吹打制成細(xì)胞懸液；（2）取編號(hào)為此A、B、C三個(gè)培養(yǎng)瓶；首先把懸液接種入A培養(yǎng)瓶中。置溫箱中靜止培養(yǎng)5～20分鐘后，輕輕傾斜培養(yǎng)瓶，讓液體集中瓶角后慢慢吸出全部培養(yǎng)液，再接種入B培養(yǎng)瓶中后；向A瓶中補(bǔ)充少許完全培養(yǎng)液置溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)；（4）培養(yǎng)B瓶中細(xì)胞5～20分鐘后，接處理A的方法，把培養(yǎng)液注入C培養(yǎng)瓶中；再向B瓶中補(bǔ)加完全培養(yǎng)基。當(dāng)三個(gè)瓶?jī)?nèi)都含有培養(yǎng)液后，均在溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)。如操作成功，次日觀察可見A瓶主要為成纖維細(xì)胞，B瓶?jī)深惣?xì)胞相雜，C瓶可能主要為癌細(xì)胞。必要時(shí)可反復(fù)處理多次，直至癌細(xì)胞純化為止。

71（三）提高腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)存活率和生長(zhǎng)率措施根據(jù)人們的經(jīng)驗(yàn)，腫瘤細(xì)胞在體外不易培養(yǎng)，建立能傳代的腫瘤細(xì)胞系更為困難。當(dāng)腫瘤組織或細(xì)胞初代接種培養(yǎng)后，常出現(xiàn)以下幾種情況：完全無細(xì)胞游出或移動(dòng)；有細(xì)胞移動(dòng)和游出，但無細(xì)胞增殖，細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間處于停滯狀態(tài)以致難以傳代；有細(xì)胞增殖，傳若干代后停止生長(zhǎng)或衰退死亡；傳數(shù)代后細(xì)胞增殖緩慢，經(jīng)過一段停滯期后，才又呈旺盛生長(zhǎng)狀態(tài)，形成穩(wěn)定生長(zhǎng)的腫瘤傳代細(xì)胞系。以上現(xiàn)象說明腫瘤細(xì)胞對(duì)體外生存條件有較高的要求，并需經(jīng)過對(duì)新環(huán)境的適應(yīng)才能生長(zhǎng)，因此欲獲得好的培養(yǎng)效果，不能局限于一般培養(yǎng)法

72采用一些特殊的措施1．適宜底物：把經(jīng)過純化的細(xì)胞接種在不同的底物上，如鼠尾膠原底層、飼細(xì)胞層等。2．生長(zhǎng)因子：應(yīng)用促細(xì)胞生長(zhǎng)因子，向培養(yǎng)液中增加一種或幾種促細(xì)胞生長(zhǎng)因子。根據(jù)細(xì)胞種類不同選用不同的促生長(zhǎng)物，常用有胰島素、氫化可的松、雌激素以及其它生長(zhǎng)因子。為提高腫瘤細(xì)胞對(duì)體外培養(yǎng)環(huán)境的適應(yīng)力和增加有活力癌細(xì)胞（干細(xì)胞）的數(shù)量，。

733.動(dòng)物體媒介培養(yǎng)方法：（1）瘤塊接種：取新鮮瘤組織，用Hanks液洗凈血污，切成1～3毫米小塊，用穿刺針頭吸一小瘤塊，用酒精棉球擦拭動(dòng)物腹部后，直接刺入皮下，注入瘤塊；（2）飼養(yǎng)觀察，待腫瘤生長(zhǎng)達(dá)較大體積后，剝?nèi)〕隽鼋M織；（3）進(jìn)行體外培養(yǎng)。（4）為防止失敗，仍取部分瘤組織繼續(xù)在裸鼠體內(nèi)傳代。通過裸鼠媒介接種，有活力的腫瘤細(xì)胞數(shù)量增多，細(xì)胞培養(yǎng)易于成功