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食品中羅丹明B的測定BJS2019051 范圍本方法規(guī)定了食品中羅丹明B的液相色譜測定方法及液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜確證方法。本方法適用于半固態(tài)調(diào)味料、花椒及花椒粉、花椒油、牛肉干、蜜餞、水果干制品中羅丹明B的測定和確證。2 原理試樣中羅丹明B用含酸的甲醇水溶液提取后，經(jīng)混合型陽離子固相萃取小柱凈化，采用液相色譜熒光檢測器檢測，外標(biāo)法定量。試樣中檢出羅丹明B后采用液相色譜質(zhì)譜/質(zhì)譜法進行確證。3 試劑和材料除另有規(guī)定外，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的一級水。3.1 甲醇（CH3OH）：色譜純。3.2 乙腈（C2H3N）：色譜純。3.3 甲酸（CH2O2）：色譜純。3.4 氨水（NH?·H?O）：色譜純。3.5 含0.1%甲酸的水溶液:取甲酸（3.3）1mL用水稀釋至1000mL，用濾膜（0.22μm，水相）過濾后備用。3.6 50%甲醇水溶液:準確量取500mL甲醇（3.1）于1L容量瓶中，用水定容至刻度。3.7 含0.1%甲酸的甲醇水溶液：取1mL甲酸（3.3），用甲醇水溶液（3.6）稀釋至1000mL。3.8 含0.1%甲酸的乙腈溶液：取1mL甲酸（3.3），用乙腈（3.2）稀釋至1000mL，濾膜（0.22μm，有機相）過濾后備用。3.9 含0.1%甲酸的乙腈水溶液：取0.1mL甲酸（3.3）和35mL乙腈（3.2），用水稀釋至100mL，混勻。3.10 含5%氨水的甲醇溶液：取5mL氨水（3.4），用甲醇稀釋至100mL，混勻。（臨用現(xiàn)配）3.11 羅丹明B標(biāo)準品：羅丹明B標(biāo)準品的分子式、相對分子量、英文名稱、CAS登錄號見表1，純度≥99%。表1羅丹明B標(biāo)準品的中文名稱、英文名稱、CAS登錄號、分子式、相對分子量
1中文名稱英文名稱CAS登錄號分子式相對分子量羅丹明BRhodamineB81-88-9C28H31ClN2O3479.011.1 羅丹明B標(biāo)準儲備液：準確稱取羅丹明B標(biāo)準品10mg（精確至0.0001g），置于100mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，制成濃度為100μg/mL的標(biāo)準儲備液。溶液轉(zhuǎn)移至試劑瓶中，置于-18℃避光保存，有效期為6個月。1.2 中間標(biāo)準溶液：準確移取0.5mL羅丹明B標(biāo)準儲備液（3.12）于100mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，混勻，此溶液的濃度為500ng/mL。置于4℃避光保存，有效期為1個月。1.3 標(biāo)準工作溶液：用含0.1%甲酸的乙腈水溶液（3.9）將中間標(biāo)準溶液（3.13）稀釋成0.0ng/mL、0.5ng/mL、1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL、20.0ng/mL、50.0ng/mL的標(biāo)準工作溶液。臨用現(xiàn)配。1.4 混合型陽離子固相萃取柱（60mg/3mL）：基質(zhì)為苯磺酸化的聚苯乙烯-二乙烯基苯高聚物，或相當(dāng)者。使用前依次用3mL甲醇，3mL水活化。1.5 陶瓷均質(zhì)子。2 儀器和設(shè)備2.1 液相色譜儀：配熒光檢測器。2.2 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀：配有電噴霧離子源（ESI源）。2.3 旋渦混合器。2.4 離心機：轉(zhuǎn)速≥8000r/min。2.5 電子天平：感量分別為0.0001g和0.01g。2.6 具塞離心管：50mL。2.7 組織搗碎機。2.8 固相萃取裝置。3 試樣制備與保存3.1 半固態(tài)調(diào)味料取適量樣品，搗碎，混勻，常溫保存?zhèn)溆谩?.2 花椒及花椒粉取適量樣品，粉碎后過40目篩，常溫保存?zhèn)溆谩?.3 花椒油充分混勻，常溫保存?zhèn)溆谩?.4 牛肉干取適量樣品，搗碎，混合均勻，冷藏保存?zhèn)溆谩?.5 蜜餞、水果干制品
2取適量樣品，搗碎，混合均勻，冷藏保存?zhèn)溆谩? 測定步驟1.1 試樣前處理1.1.1 提取：準確稱取2g（香辛料樣品稱取1g，精確至0.01g）試樣置于50mL塑料離心管中，準確加入10.0mL含0.1%甲酸的甲醇水溶液（3.7），混勻，加入陶瓷均質(zhì)子兩顆（調(diào)味油試樣除外），于旋渦混勻器上渦旋15min，于8000r/min離心10min，取3mL提取液層溶液過0.45μm有機相濾膜后待凈化。1.1.2 凈化：準確移取1.0mL提取液（6.1.1）至固相萃取柱（3.15）中，依次用3mL0.1%甲酸水溶液（3.5）、3mL水、3mL甲醇淋洗固相萃取柱。用6mL氨水甲醇溶液（3.10）洗脫目標(biāo)物，并收集洗脫液，洗脫溶液在45℃下，用氮氣吹至近干，殘渣用1.0mL0.1%含酸的乙腈水溶液（3.9）溶解（香辛料樣液殘渣用0.5mL溶解），過0.22μm有機相濾膜上機測定。1.2 儀器參考條件a)色譜柱：C18柱，4.6mm×100mm，粒徑3.5μm，或性能相當(dāng)者。b)流動相：A為0.1%甲酸水溶液（3.5），B為乙腈（3.2），梯度洗脫程序見表2。c)流速：1.0mL/min。d)柱溫：35℃。e)進樣量：10μL。f）激發(fā)波長：550nm；發(fā)射波長：580nm。表2梯度洗脫程序時間(min)流動相A（%）流動相B（%）Initial65350.165356.030706.530708.0653510.065351.3 空白試驗除不加試樣外，均按試樣同法操作。2 結(jié)果計算
3試樣中羅丹明B的含量按式（1）計算獲得：X=C×Vm×1000×f………….（1）式中：X—試樣中羅丹明B的含量，單位為毫克每千克（mg/kg）；c—試樣中羅丹明B峰面積對應(yīng)的濃度，單位為納克每毫升（ng/mL）；V—試樣定容體積，單位為毫升（mL）；m—稱樣量，單位為克（g）;?—稀釋因子。計算結(jié)果以重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留三位有效數(shù)字。1 精密度在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的10%。2 其他當(dāng)稱樣量為2g（香辛料樣品稱取1g）時，本方法中羅丹明B的檢出限為0.0025mg/kg，定量限為0.005mg/kg；液相色譜質(zhì)譜確證法的檢出限為0.0025mg/kg，定量限為0.005mg/kg。3 確證實驗當(dāng)試樣中檢出羅丹明B時，可按附錄B方法進行確證。
4附錄A羅丹明B液相色譜圖0.01.02.03.04.05.06.07.08.09.010.0min0123456789101112mVEx:550nm,Em:580nm圖A.1羅丹明B標(biāo)準溶液色譜圖（濃度：5ng/mL）
5附錄B羅丹明B確證實驗B.1.液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜參考條件a)色譜柱：C18柱，100×3.0mm，粒徑1.7μm，或性能相當(dāng)者。b)流動相：A為含0.1%甲酸的水溶液（3.8），B為含0.1%甲酸的乙腈溶液（3.9）。梯度洗脫程序見表B.1。c)流速：0.4mL/min。d)柱溫：40℃。e)進樣量：1μL。h)質(zhì)譜參考條件參見B.2表B.1梯度洗脫條件時間（min）流動相A（%）流動相B（%）0.0080201.580202.55953.55954.580205.58020B.2質(zhì)譜參考條件a)離子源：電噴霧離子源（ESI源）。b)檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）。c)掃描方式：采用正離子模式掃描。d)電噴霧電壓：5500V。e)離子源溫度：550℃。f)霧化氣壓力：60.0psi。g)輔助氣壓力：50.0psih)氣簾氣壓力：25.0psii)定性離子對，定量離子對，去簇電壓和碰撞能量見表B.2。
6表B.2羅丹明B質(zhì)譜參數(shù)分析物離子對m/z去簇電壓V碰撞能量eV羅丹明B443.2/399.3*2059443.2/355.12081*代表定量離子對。注：附錄B所列參考質(zhì)譜條件僅供參考，當(dāng)采用不同質(zhì)譜儀器時，儀器參數(shù)可能存在差異，測定前應(yīng)將質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化到最佳。B.3.定性判定按照B.1和B.2的條件測定試樣和標(biāo)準溶液。如果試樣中質(zhì)量色譜峰保留時間與標(biāo)準溶液一致（變化范圍在±2.5%之內(nèi)），試樣中目標(biāo)化合物的兩個子離子的相對豐度與濃度和標(biāo)準溶液的相對豐度和濃度一致，相對豐度偏差不超過表B.3規(guī)定的范圍，則可判定試樣中含有羅丹明B。表B.3定性確證時相對離子豐度的最大允許偏差相對離子豐度（%）>50>20~50>10~20≤10允許的相對偏差（%）±20±25±30±50羅丹明B的多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）離子色譜圖見圖B.1。圖B.1羅丹明B標(biāo)準溶液多反應(yīng)監(jiān)測離子色譜圖本方法負責(zé)起草單位：成都市食品藥品檢驗研究院。
7驗證單位：北京市疾病預(yù)防控制中心、山東省食品藥品檢驗研究院、遼寧省食品檢驗檢測院、山西省食品藥品檢驗所、四川省食品藥品檢驗檢測院。主要起草人：郭靚、李紹波、葉梅、肖全偉、喬秀明、林紅
