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《亞型禽流感血凝抑制試驗課件》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
內(nèi)容1、血凝試驗(HA)：檢測抗原的效價2、血凝抑制試驗(HI)：檢測抗體3、注意事項
1材料1、90°的96孔微量反應板、單道及多道微量移液器、吸頭、加樣槽、燒杯、吸管、量杯、微量振蕩器；2、H7亞型禽流感抗原、陰陽性血清、稀釋液（PBS）；
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3實驗原理1、HA原理：某些病毒或病毒的血凝素能選擇性地使某種動物地紅細胞發(fā)生凝集，這種凝集紅細胞的現(xiàn)象稱為血凝（HA）,也稱直接血凝反應（紅細胞不流淌）。病毒顆粒紅細胞
42、HI原理：當病毒的懸液中加入特異性抗體，且這種抗體的量足以抑制病毒顆粒或其血凝素時，則紅細胞表面的受體就不能與病毒顆?；蜓刂苯咏佑|。這時紅細胞的凝集現(xiàn)象就被抑制，稱為紅細胞凝集抑制（HI）反應，也稱血凝抑制反應。Iamlate！抗體抗原
5血凝試驗（HA)1、血凝板上的1-12孔每孔加入25ul生理鹽水2、在第1孔內(nèi)加入25ul抗原，反復吸吹3-5次使其混勻，然后從第一孔吸取25ul加入到第二孔，又反復洗吹3.5次吸取25ul加入到第三孔，依次倍比稀釋至第11孔，最后從11孔棄去25ul3、每孔再次加入生理鹽水25ul4、每孔加入1％雞紅細胞懸液25ul5、在振蕩器上振蕩均勻后，放于室溫（20-25°C）下靜置30分鐘，或2-8℃45-60分鐘，紅細胞對照孔呈紐扣狀時判定結果。6、結果判定。將反應板傾斜60°，觀察紅細胞有無淚滴狀流淌，完全凝集無淚珠狀流淌（100%）的最高稀釋倍數(shù)為抗原血凝價。
61234567891011122×4×8×16×32×64×128×256×512×1024×2048×紅細胞對照生理鹽水252525252525252525252525抗原生理鹽水25252525252525252525252525252525252525252525棄2525紅細胞252525252525252525252525結果＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋+＋＋＋+＋＋＋++++++－－（紅細胞沉積在底部）抗原效價測定
7抗原效價29
84個單位抗原配制例如：抗原效價的最高稀釋倍數(shù)為28（1：256），則4個單位抗原為26，256÷4=1:64，即在63毫升的PBS液中加入1毫升抗原即可。
9血凝抑制試驗1、在血凝板上1－12孔內(nèi)各加入25ul生理鹽水；2、在第1孔內(nèi)加入被檢血清25ul，然后倍比稀釋至第10孔，最后從第10孔中吸取25ul棄掉；3、第1－11孔內(nèi)加入4單位抗原25ul（第11孔為抗原對照第）4、振蕩混勻，放于室溫中靜置30分鐘或2-8°50分鐘；5、1-12孔每孔加入1％雞紅細胞懸液25ul（12孔為紅細胞對照）；6、振蕩，放于室溫靜置30分鐘，或2-8℃45-60分鐘；7、結果判定。以完全抑制的4個單位抗原的最高稀釋倍數(shù)為該血清的HI效價。滴度≤23為陰性，≥24為陽性。8、見下圖
10下圖中的抗體效價依次為28、20、25、28
11抗體滴度：9、1、6、0、5、0、0；陽性對照：9
12下圖中的抗體效價均為陰性，紅細胞對照12孔成立（流淌），11孔抗原對照不流淌。
131%紅細胞懸液的制備采集2-3只健康成年公雞或無禽流感和新城疫等抗體的健康公雞血液與等體積的阿氏保護液（3.8%抗凝劑）混合，用PBS液（生理鹽水代替）洗滌3次，吸掉血漿和白細胞膜，每次以3000轉(zhuǎn)/分鐘離心3-5分鐘，洗至上清液由淡黃色變?yōu)橥该魃Ｗ詈笥靡埔浩骰蛘呖潭任芪悍e的紅細胞泥，用PBS配制成1%的懸液，于4℃保存?zhèn)溆?。?份紅細胞泥+9份生理鹽水）
14阿氏保護液配制：葡萄糖2.05克，檸檬酸鈉0.8克，檸檬酸（枸櫞酸）0.055克，氯化鈉0.42克，加蒸餾水至100毫升，加熱溶解后調(diào)PH值至6.1，然后高壓滅菌15分鐘，2-8°保存?zhèn)溆?.8%抗凝劑配制：枸櫞酸鈉3.8克，加入蒸餾水100毫升。PBS液：用臨床用生理鹽水代替。配方略。
15正確的操作校準的儀器優(yōu)質(zhì)的試劑標準、規(guī)范充分準備?。?！檢測質(zhì)量控制措施注意
16注意事項1、四個單位抗原，紅細胞懸液使用過程中要輕輕搖勻；2、移液器的吸頭在反復洗吹時要插入液面以下但不可過深，避免使用中速度過快產(chǎn)生過多氣泡造成移液量減少，每孔混勻完畢要將吸頭內(nèi)液體排盡。
17注意事項3、移液器使用時要用力均勻不可過力，吸頭要安裝牢固，防止使用過程中漏氣或者掉落。吸頭盡量使用一次性的，若反復使用要清洗干凈，最好用超聲波清洗機清洗，高壓滅菌后使用，如果發(fā)現(xiàn)吸頭堵住不能吸到液體或者彎曲及時淘汰。4、移液器在滴加液體，特別是在加抗原和紅細胞懸液時一定不要深入液面中造成交叉污染，影響濃度造成結果較大誤差，可以嘗試懸空垂直加樣。
18注意事項5、4個單位抗原配備一定要準確，如果配備的抗原效價高，那么抗體滴度就會低，反之抗體滴度會高，一般現(xiàn)用現(xiàn)配。回歸試驗來判定效價測定的正確與否。做法：做四排，每排的1-4孔加入生理鹽水50UL，取配好的四個單位抗原50UL與第一孔做倍比稀釋至最后一孔并棄掉50UL，最后每孔加入50UL紅細胞懸液，震蕩，靜置20分鐘觀察結果。如果第一和第二孔完全凝集不流淌，第三和第四孔不凝集流淌，則說明四個單位抗原配制正確。6、紅細胞懸液在洗滌的過程中一定要把白細胞膜吸取干凈，顏色為鮮紅色，如果是暗紅色很有可能發(fā)生了溶血。如果采集的紅細胞免疫過禽流感，那么可以多洗滌幾遍。紅細胞懸液一般情況下可以存放3天，如果要保持一周左右就要在無菌情況下存放在阿氏保護液中。
19注意事項7、環(huán)境溫度一定要重視，一般要求在室溫下20-25°進行，如果低于15°反應結果就出現(xiàn)的慢；如果高于30°結果會出現(xiàn)的快；如果低于4°會發(fā)生紅細胞自凝現(xiàn)在。因此，觀察時間可以適當根據(jù)反應情況縮短，所以實驗室要裝有空調(diào)和溫度計。8、微量反應版如果是有機玻璃的一定要清洗干凈，孔底要透亮，無磨損毛糙無劃痕和有殘留物。不干凈的反應板在試驗中會出現(xiàn)自凝現(xiàn)象。使用正規(guī)廠家生產(chǎn)的一次性微量板就可杜絕這種情況。
20注意事項9、整板無紅細胞凝集（流淌）現(xiàn)象，給人誤認為抗體效價均為12。原因分析：1、4個單位抗原配制過低不足以凝集紅細胞；2、環(huán)境溫度過高；3、讀數(shù)時間拖延；4、沒有加4個單位抗原。10、整板紅細胞凝集（不流淌）現(xiàn)象，原因分析：紅細胞受污染或保存時間過長；4個單位抗原配制失敗或滴加失誤；生理鹽水受到污染。11、跳孔：倍比稀釋時順序錯亂；移液器吸取的量不準確。
21做好個人防護
