磷酸化蛋白檢測

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磷酸化蛋白檢測

1磷酸化蛋白檢測與信號轉導研究的關系磷酸化作為一種分子開關,能夠動態(tài)調節(jié)酶活性及蛋白蛋白相互作用,可形成一系列蛋白次序磷酸化的級聯(lián)反應將信號快速傳遞,因而廣泛存在于各種信號傳導途徑;蛋白磷酸化是細胞信號傳導的關鍵步驟,在細胞代謝、生長、增殖、凋亡、癌變和其他生命過程中都扮演著重要角色。如與MAPK通路密切相關的EGFR,ERK,p38,Caveolin以及STAT通路相關蛋白都是通過磷酸化和去磷酸化改變蛋白活性,借以傳遞信號,調控細胞的生命活動。癌癥、感染、炎癥以及其它疾病往往伴隨著異常的蛋白磷酸化現(xiàn)象,因此,這些磷酸化蛋白也是藥物研發(fā)人員感興趣的靶分子

2磷酸化蛋白檢測的常用方法最常用地方法是利用32P標記的無機磷酸鹽(32Pi)進行生物合成標記對蛋白磷酸化的研究一般依靠傳統(tǒng)的Westernblot方法和蛋白激酶實驗(enzymatickinaseassays)高通量磷酸化蛋白定量檢測技術--液相蛋白芯片技術磷酸化蛋白多參數(shù)檢測--胞內(nèi)流式細胞術

3YYYY非磷酸化特異性抗體?檢測總蛋白:非磷酸化蛋白+磷酸化蛋白?抗原:重組蛋白片段磷酸特異性抗體?檢測磷酸化蛋白中的磷酸化位點?抗原:合成的4-10mer磷酸化肽段Y磷酸化特異性及非特異性抗體的特點

4液相蛋白芯片技術-BDCBAFlexsetCaptureBeadsLysateSampleDetectorAntibodiesWashAnalyzeonflowcytometer

5微球和流式檢測平臺的強大結合+100100101101102102103103104104BeadIntensityFL3(670LP)DetectorAbIntensityFL2(585/42BP)

6微球在流式細胞儀上的識別方式ABCDEFGHI123456789

7TheBD?CBAFlexSet磷酸化蛋白檢測技術檢測細胞裂解液中的磷酸化蛋白同時定量分析同一樣本中多個磷酸化蛋白可根據(jù)實驗需要靈活選擇待檢測的種類顯而易見的優(yōu)點:實驗操作簡單,快速;樣本需求量少,不論是檢測一個還是N個磷酸化蛋白,所需樣本量都是一樣的;線性范圍寬,且得到定量結果,units/ml;檢測靈敏度與Westernblot可比,甚至更好可以自主選擇待檢蛋白,可以多達幾十種蛋白同時檢測

8實驗方法學評估與已知經(jīng)典的檢測方法比較Westernblot不同細胞激活狀態(tài)評估實例:刺激作用下T細胞受體信號轉導反應的分析

9BDCBAandWesternblot檢測細胞裂解液中phospho-ERK水平050010001500RELATIVEUNITSOFACTIVITYActivatedcellsControlcellsA431+EGFHeLa+anisoU937+GMCSFMacro+IFN/LPS293+UVHeLa+TNF3T3+osmoticCBAWesternblot

10BDCBAandWesternblot檢測細胞裂解液中phospho-JNK水平0500100015002000RELATIVEUNITSOFACTIVITYActivatedcellsControlcellsA431+EGFHeLa+anisoU937+GMCSFMacro+IFN/LPS293+UVHeLa+TNF3T3+osmoticCBAWesternblot

11BDCBAandWesternblot檢測細胞裂解液中phospho-P38水平A431+EGFHeLa+anisoU937+GMCSFMacro+IFN/LPS293+UVHeLa+TNF02500500075001000012500RELATIVEUNITSOFACTIVITYActivatedcellsControlcells3T3+osmoticCBAWesternblot

12BDCBAphospho-ZAP70檢測線性度檢測及與Westernblot靈敏度比較110100100010000MFI1101001000UNITS/mlJurkat+anti-CD3/CD28RecombinantStandard200,000100,00050,00025,0003125625012,500156278130secondexposure10minuteexposureCellnumberCBAWesternBlot

13實驗流程準備并調試流式細胞儀準備待檢樣本梯度稀釋標準品混勻并稀釋捕獲微球吸取50ul到試管中稀釋PE標記的檢測抗體并吸取50ul到對應的試管中分別吸取50ul標準品和待檢樣本到對應的試管中避光室溫孵育4個小時加入1ml洗液,離心去上清加入300ul洗液,上機分析

14T細胞受體信號轉導途徑LckZAP-70PItkPMAPKKKPIKKNF-kBRasGrb2SOSRacPPPLCPPDAGPKCPVAVSLP-76PLATPPPPPPPPPPPPRasMEKERKJNKp38MKK4,7MKK3,6MEKK1-4ElkJunATF2MEKK4LATPPRSKPP

15KineticsofJurkatcellactivationwith anti-CD3/CD28110100FOLDINCREASEINUNITS/ML05101520TIME(MINUTES)RSKJunLATItkZAP-70PLCp38JNKERK

16Tcellreceptorsignalingresponsestotreatmentwithanti-CD3/CD28antibodiesCellswereactivatedwithanti-CD3/CD28for2minutes.SDSwasaddedtoafinalconcentrationof1%andthematerialwasplacedinaboilingwaterbathfor5minutes.DatainMFIunits.

17EffectofPD-98059treatmentonTcellreceptorsignalingresponsetoanti-CD3/CD28Jurkatcellswerepre-incubatedwithPD-98059(MEKinhibitor)beforebeingactivatedwithanti-CD3/CD28.

18EffectofPP2treatmentonTcellreceptorsignalingresponsetoanti-CD3/CD28Jurkatcellswerepre-incubatedwithPP2(Srcfamilykinaseinhibitor)beforebeingactivatedwithanti-CD3/CD28.

19BD?CBAFlexSetphosphoproteinassays

20具有歷史意義的磷酸化檢測技術(phosflow)-單細胞水平的信號轉導研究

21Westernblot2DElectrophoresisELISABead-basedArray-basedMassspec流式細胞術檢測細胞的膜表面分子.對于稀少的細胞也能夠得到許多信息能夠將疾病的免疫狀態(tài)與具體的細胞種類聯(lián)系起來.PokeProd細胞類型的鑒別細胞內(nèi)信號轉導的發(fā)生得到關于信號轉導網(wǎng)絡的概念所以實驗都是在單個細胞中完成標準的生物化學技術(1975-2003)免疫系統(tǒng)研究(1975-2003)HeterogeneousCellpopulationHomogenized

22單細胞水平的磷酸化蛋白檢測的特點結合了流式細胞術的優(yōu)勢:快速,敏感,定量,多參數(shù)分析;所需細胞數(shù)少,可以檢測一些利用傳統(tǒng)方法無法檢測的微量細胞亞群;無需純化細胞,可以在最原始的樣本中分析不同細胞亞群的信號轉導事件,因此為臨床信號轉導的研究開辟了一條實際可行的道路;減少了人為操作帶來的誤差,結果更接近機體的真實情況可以更為徹底的了解不同的細胞亞群在免疫防御中的作用

23Westernblot和PhosFlow技術的比較AtheoreticalexperimentcomparingWesternblotandflowcytometrywiththreesamplesandaproteinofinterestat1,10,or50copiespercell.Sample2and3lookthesameviaWesternblot,butwhenstainedwithfluorescentlylabeledantibodies,thedifferencesbetweenthesamplesbecomemorerelevant.(Source:P.O.Krutziketal./ClinicalImmunology110(2004)206–221)

24樣本的處理改變了細胞對于刺激的的反應Phospho-p44/42Simultaneousmeasurementofmultiple activekinasestatesusingpolychromatic flowcytometryPerezODandNolanGPNatureBiotechnology20:155,2002

25ControlUnstimulatedIL4/IL6Simulated全血樣本pStat6pStat3PBMCpStat6pStat3樣本的處理改變了細胞對于刺激的的反應

26新鮮的全血與放置24小時的全血中磷酸化信號的比較Humanperipheralbloodwereeitherleftuntreated(openhistogram)ortreated(shadedhistogram)withhumanIL-6(100ng/ml)orIL-4(100ng/ml)for15minutesat37°C.ThecellswerethenfixedusingBDTMPhosFlowLyse/Fixbufferfor10minutesat37°C,followedbyPermBufferIIIfor30minutesonice.ThesecellswerethenstainedwithPEAnti-Stat3(pY705)orPEAnti-Stat6(pY641).Fresh24hour@4oC24hour@RTSTAT3PESTAT6PE

27Phosflow與經(jīng)典的WesternBlots的比較

28PDGFR(pY771)on3T3+/-PDGF:TimeCourseC25103060

29固定2%多聚甲醛處理10-15min.破膜以酒精/去污劑處理為基礎染色存儲于PBS+1%BSA中的直接熒光標記的抗體檢測分析stainingcontrolsarecrucial.胞內(nèi)磷酸化蛋白檢測技術示意圖PermeabilizeStainandAnalyze

30IL-4+IL-6刺激全血后檢測胞內(nèi)Stat-3/Stat-6磷酸化水平

31Phosflow的應用及前景高通量藥物篩選及臨床實驗中的藥效監(jiān)測研究疾病下信號轉導的狀態(tài)以及對于不同化合物的反應性,以期能夠根據(jù)患者的病程多身定制治療方案可以快速得到患者對于藥物的反應,無需根據(jù)長時間的病程觀測臨床信號網(wǎng)絡解析系統(tǒng)生物學:單細胞信號網(wǎng)絡制圖

32X-linkedSCIDresultsfromamutationintheinterleukin2receptorgamma(IL2RG)genewhichproducesthecommongammachainsubunit,acomponentofseveralILreceptors.IL2RGactivatesanimportantsignallingmolecule,JAK3.AmutationinJAK3,locatedonchromosome19,canalsoresultinSCID.ControlJAK3SCIDX-SCID(gc)Black:ControlGreen:IL-2stimcellsKimberlyGilmoreGreatOrmondStreetHospitalSeverecombinedimmunodeficiencypStat5pStat5pStat5

3311ColorFlowCytometryLookingatSignalinginSubpopulationsofCellsPerez&Nolan,NatureBiotechnology,Vol20,p155-162Multi-DimensionalAnalysis

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35ClusteringofBiosignature,ClinicalSignificance

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37SystemsBiology:SignalingNetworkMappingKinase1Kinase11Kinase2Kinase6Kinase3Kinase1Kinase3Kinase1Kinase11Kinase4Kinase9Kinase11Kinase11Surface2p-p44/42p-p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rafp44/42mekPLCgPIP3PIP2jnkp38AKTPKAPKCMITSupercomputer

38謝謝云南省腫瘤醫(yī)院腫研所 謝謝各位的傾聽!

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