WST 562—2017 克-雅病診斷

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ICS11.020C59WS中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)WS/T562—2017克-雅病診斷DiagnosisforCreutzfeldt-Jakobdisease2017-07-24發(fā)布2018-02-01實(shí)施中國人民共和國國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)發(fā)布

1WS/T562—2017目次前言.................................................................................II1范圍................................................................................12術(shù)語和定義..........................................................................13縮略語..............................................................................34診斷原則............................................................................35診斷依據(jù)............................................................................36鑒別診斷............................................................................5附錄A（規(guī)范性附錄）腦脊液14-3-3蛋白Westernblot檢測(cè).............................6附錄B（規(guī)范性附錄）腦組織病理學(xué)檢測(cè)...............................................7Sc附錄C（規(guī)范性附錄）腦組織PrP的免疫組織化學(xué)檢測(cè)...................................9Sc附錄D（規(guī)范性附錄）腦組織PrP的Westernblot檢測(cè).................................11Sc附錄E（規(guī)范性附錄）vCJD患者扁桃體PrP的Westernblot檢測(cè)........................13Sc附錄F（規(guī)范性附錄）vCJD患者扁桃體PrP的免疫組織化學(xué)檢測(cè).........................13附錄G（規(guī)范性附錄）PRNP基因序列、129位及219位氨基酸多態(tài)性檢測(cè)..................15附錄H（資料性附錄）遺傳或家族型人類朊病毒病PRNP基因突變位點(diǎn).....................19附錄I（資料性附錄）克-雅病的鑒別診斷.............................................20參考文獻(xiàn).............................................................................22I

2WS/T562—2017前言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1－2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所、北京市友誼醫(yī)院、廣州市中山醫(yī)院、河南省疾病預(yù)防控制中心、北京市疾病預(yù)防控制中心。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：董小平、韓俊、陳操、石琦、王得新、高晨、田嬋、夏勝利、李洵樺、張秀春。II

3WS/T562—2017克-雅病診斷1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了克-雅病和遺傳或家族型人類朊病毒?。òㄟz傳或家族型克-雅病、吉斯特曼-施特勞斯綜合征、致死性家族型失眠癥）的診斷原則、診斷依據(jù)、診斷分類和鑒別診斷。本標(biāo)準(zhǔn)適用于全國各級(jí)各類醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)及其醫(yī)務(wù)人員對(duì)克-雅病和遺傳或家族型人類朊病毒?。òㄟz傳或家族型克-雅病、吉斯特曼-施特勞斯綜合征、致死性家族型失眠癥）的診斷。2術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。2.1克-雅病Creutzfeldt-Jakobdisease德國科學(xué)家CreutzfeldtH.G.和JakobA.M.在1922年首先報(bào)道的一種罕見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，后被證實(shí)為人類的朊病毒病，包括散發(fā)型、遺傳或家族型、醫(yī)源型和變異型。其中散發(fā)型約占病例總數(shù)的85％左右，遺傳或家族型約占病例總數(shù)的10％～15％左右，醫(yī)源型約占病例總數(shù)的1％左右。2.2朊病毒病priondisease一類由朊病毒引起的人類和動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的可傳播性、退行性疾病。該病潛伏期長(zhǎng)，病死率為100％。朊病毒相關(guān)疾病、可傳播性海綿狀腦病也為此類疾病的專有名詞。2.3朊病毒prion朊病毒病的感染因子，又稱羊瘙癢因子樣或淀粉樣朊蛋白（異常朊蛋白）（scrapie,Scamyloid-formingisoformoftheprionprotein，PrP）。目前認(rèn)為是一種不含核酸、具有自我復(fù)制能力的感染性蛋白粒子，由細(xì)胞表面的正常朊蛋白轉(zhuǎn)變而成的異常形式，具有感染性，可抵抗蛋白酶的水解作用（蛋白酶抗性），也有稱為朊毒體、朊粒。2.4朊蛋白prionproteinC一種正常的細(xì)胞蛋白，又稱細(xì)胞型朊蛋白（cellularprionprotein，PrP），在中樞神經(jīng)系統(tǒng)（腦和脊髓組織）的神經(jīng)元細(xì)胞以及膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，在機(jī)體其他組織包括外周組織、淋巴組織等細(xì)胞中也有表達(dá)。1

4WS/T562—20172.5散發(fā)型克-雅病sporadicCreutzfeldt-Jakobdisease大多數(shù)克-雅病病例呈散發(fā)型，無地理上的聚集性，在病人之間無明顯傳播現(xiàn)象，由于至今沒有發(fā)現(xiàn)明確的發(fā)病原因，故稱為散發(fā)型克-雅病。此類疾病的發(fā)病年齡在14歲～92歲之間，平均為65歲。發(fā)病率為1～2人/每百萬人/每年，男女病人的比例與整個(gè)人口的性別比例一致，與社會(huì)經(jīng)濟(jì)狀況無關(guān)。2.6醫(yī)源型克-雅病iatrogenicCreutzfeldt-Jakobdisease通過朊病毒污染的手術(shù)器械、角膜及硬腦膜移植或腦垂體提取物、生長(zhǎng)激素及促性腺激素治療會(huì)感染受體患者，引起醫(yī)源型克-雅病。2.7遺傳或家族型人類朊病毒病geneticorfamilialhumanpriondisease遺傳或家族型人類朊病毒病包括遺傳或家族型克-雅病、吉斯特曼-斯特勞斯綜合征、致死性家族型失眠癥。發(fā)病率約占整個(gè)人類朊病毒病病例的10％～15％。2.8遺傳或家族型克-雅病geneticorfamilialCreutzfeldt-Jakobdisease是一類遺傳或家族型人類朊病毒病，為顯性特征遺傳性疾病。當(dāng)人類朊蛋白基因出現(xiàn)特定位點(diǎn)的點(diǎn)突變，以及出現(xiàn)特定的八肽重復(fù)插入或缺失時(shí)，引起此類疾病。此類患者的臨床表現(xiàn)與散發(fā)型克-雅病相似，但依據(jù)突變位點(diǎn)和類型的不同，其發(fā)病年齡、臨床病程、臨床輔助檢查、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)和病理變化有所差異。2.9吉斯特曼-施特勞斯綜合征Gerstmann-Str?ussler-Scheinkersyndrome此類患者的朊蛋白編碼基因出現(xiàn)特定的點(diǎn)突變及八肽插入，在臨床表現(xiàn)和病理特征上與遺傳或家族型克-雅病明顯不同，臨床表現(xiàn)為漸進(jìn)性小腦共濟(jì)失調(diào)，神經(jīng)病理上可見特征性的淀粉樣斑塊沉積。2.10致死性家族型失眠癥fatalfamilialinsomnia當(dāng)人類朊蛋白基因第129位密碼子為甲硫氨酸純合子，第178位氨基酸由天冬氨酸（D）突變成天冬酰胺（N）時(shí)，此類患者出現(xiàn)嚴(yán)重的睡眠障礙。病理上表現(xiàn)為顯著的丘腦神經(jīng)元丟失和膠質(zhì)增生，很少或幾乎沒有海綿狀變性。2.11變異型克-雅病variantCreutzfeldt-Jakobdisease1996年在英國首先發(fā)現(xiàn)的克-雅病新變種，多發(fā)生于年輕人，且其臨床癥狀和病理改變均與散發(fā)型克-雅病有所不同。此類病人的大腦和小腦出現(xiàn)廣泛的空泡樣變及“花瓣樣”的異常朊蛋白斑塊沉積。2

5WS/T562—2017已經(jīng)證實(shí)變異型克-雅病與20世紀(jì)80年代中期在英國和歐洲暴發(fā)的牛海綿狀腦病相關(guān)。3縮略語下列縮略語適用于本文件。CJD：克-雅?。–reutzfeldt-Jakobdisease）FFI：致死性家族型失眠癥（fatalfamilialinsomnia）fCJD：家族型克-雅?。╢amilialCJD）GSS：吉斯特曼-施特勞斯綜合征（Gerstmann-Str?ussler-Scheinkersyndrome）gCJD：遺傳型克-雅?。╣eneticCJD）iCJD：醫(yī)源型克-雅?。╥atrogenicCJD）PRNP：朊蛋白基因（prionproteingene）PrP：朊蛋白（prionprotein）CPrP：細(xì)胞型朊蛋白（正常朊蛋白）（cellularprionprotein）ScPrP：羊瘙癢因子樣或淀粉樣朊蛋白（異常朊蛋白）（scrapie,amyloid-formingisoformoftheprionprotein）sCJD：散發(fā)型克-雅?。╯poradicCJD）TSE：可傳播性海綿狀腦病（transmissiblespongiformencephalopathy）vCJD：變異型克-雅?。╲ariantCJD）4診斷原則根據(jù)患者的流行病學(xué)史、臨床癥狀、臨床輔助檢查、實(shí)驗(yàn)室及基因?qū)W檢測(cè)綜合判斷。診斷結(jié)果分為疑似診斷、臨床診斷和確診診斷，其中病例的確診診斷依賴于在患者的腦組織中檢出具有蛋白酶抗性的ScPrP和/或出現(xiàn)海綿狀變性和/或具有特定的PRNP基因突變。5診斷依據(jù)5.1散發(fā)型克-雅病5.1.1病史與流行病學(xué)史病史與流行病學(xué)史如下：a)具有進(jìn)行性癡呆癥狀；b)臨床病程＜2年；c)常規(guī)檢測(cè)排除其他疾病；d)無明確醫(yī)源性接觸史。5.1.2臨床表現(xiàn)臨床表現(xiàn)如下：a)肌陣攣；b)視覺障礙或小腦共濟(jì)失調(diào)；c)錐體/錐體外系功能異常；d)無動(dòng)性緘默。3

6WS/T562—20175.1.3臨床檢查特征性的臨床檢查結(jié)果如下：a)在病程中腦電圖出現(xiàn)周期性三相波；b)頭顱MRI成像可見殼核/尾狀核異常高信號(hào)，或者彌散加權(quán)像顯示對(duì)稱性灰質(zhì)“緞帶(ribbon)征”。5.1.4實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)特征性的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果如下：a)腦脊液14-3-3蛋白檢測(cè)為陽性（見附錄A）；b)腦組織病理學(xué)檢測(cè)顯示具有典型/標(biāo)準(zhǔn)的神經(jīng)病理學(xué)改變，即出現(xiàn)海綿狀變性（見附錄B）；Scc)腦組織免疫組織化學(xué)檢測(cè)存在蛋白酶抗性PrP的沉積（見附錄C）；Scd)腦組織Western印跡法檢測(cè)存在蛋白酶抗性PrP（見附錄D）。5.1.5診斷分類診斷分類主要包括以下三種：a)疑似診斷：符合5.1.1加5.1.2任意兩條；b)臨床診斷：在疑似診斷基礎(chǔ)上，符合5.1.3任意一條或5.1.4a）；c)確診診斷：在疑似診斷基礎(chǔ)上，符合5.1.4中b）、c）、d）任意一條。5.2醫(yī)源型克-雅病5.2.1病史與主要臨床表現(xiàn)與散發(fā)型克-雅病相似。5.2.2診斷分類診斷分類僅為確診診斷。在散發(fā)型克-雅病確診診斷基礎(chǔ)上，符合以下任意一項(xiàng)：a)接受由人腦提取的垂體激素治療的病人出現(xiàn)進(jìn)行性小腦綜合征；b)確定的暴露危險(xiǎn)，例如曾接受過來自CJD病人的硬腦膜移植、角膜移植等手術(shù)。5.3變異型克-雅病5.3.1病史與流行病學(xué)史病史與流行病學(xué)史如下：a)進(jìn)行性神經(jīng)精神障礙；b)病程≥6個(gè)月；c)常規(guī)檢查不提示存在有其他疾?。籨)無明確醫(yī)源性接觸史；e)排除遺傳或家族型人類朊病毒病。5.3.2臨床表現(xiàn)臨床表現(xiàn)如下：a)早期精神癥狀（抑郁、焦慮、情感淡漠、退縮、妄想）；4

7WS/T562—2017b)持續(xù)性疼痛感（疼痛和/或感覺異常）；c)共濟(jì)失調(diào)；d)肌陣攣、舞蹈癥、肌張力障礙；e)癡呆。5.3.3臨床檢測(cè)特征性的臨床檢測(cè)結(jié)果如下：a)早期腦電圖無典型的三相波（晚期可能出現(xiàn)三相波）；b)MRI：彌散加權(quán)像、液體衰減反轉(zhuǎn)恢復(fù)成像顯示雙側(cè)丘腦枕（后結(jié)節(jié)）高信號(hào)。5.3.4實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)特征性的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果如下：Sca)扁桃體Western印跡法檢測(cè)存在蛋白酶抗性PrP（見附錄E）或扁桃體免疫組織化學(xué)檢測(cè)證實(shí)Sc具有PrP沉積（見附錄F）；b)腦組織病理學(xué)檢測(cè)顯示，大腦和小腦廣泛的空泡樣變（見附錄B）；Scc)腦組織免疫組織化學(xué)檢測(cè)證實(shí)具有“花瓣樣”的蛋白酶抗性PrP斑塊沉積（見附錄C）；Scd)腦組織Western印跡法檢測(cè)存在蛋白酶抗性PrP（見附錄D）。5.3.5診斷分類診斷分類包括以下三種：a)疑似診斷：符合5.3.1加5.3.2中的任意4項(xiàng)加5.3.3a）；b)臨床診斷：在疑似診斷的基礎(chǔ)上符合5.3.3b）；或5.3.1加5.3.4a）；c)確診診斷：在5.3.1加5.3.4中b）、c）、d）任意一條。5.4遺傳或家族型人類朊病毒病5.4.1病史與流行病學(xué)史在一級(jí)親屬中存在遺傳或家族型人類朊病毒病確診病例。5.4.2診斷分類診斷分類包括以下兩種：a)疑似診斷：在符合sCJD疑似診斷標(biāo)準(zhǔn)或出現(xiàn)進(jìn)行性神經(jīng)精神癥狀的基礎(chǔ)上，加5.4.1。b)確診診斷：在疑似診斷的基礎(chǔ)上，病人PRNP基因序列檢測(cè)（見附錄G）證實(shí)具有特定的基因突變（參見附錄H）。6鑒別診斷克-雅病的診斷應(yīng)與病毒性腦炎、橋本腦病、線粒體腦病、阿爾茨海默病、血管性癡呆、中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤及其他腦腫瘤、皮層靜脈血栓形成及副腫瘤性亞急性小腦變性相鑒別（參見附錄I）。5

8WS/T562—2017附錄A（規(guī)范性附錄）腦脊液14-3-3蛋白Westernblot檢測(cè)A.1原理CJD病人腦脊液中14-3-3蛋白含量往往增高。腦脊液經(jīng)SDS-PAGE電泳、電轉(zhuǎn)后，14-3-3蛋白與特異性抗體進(jìn)行反應(yīng)，顯色后出現(xiàn)30KD左右的蛋白條帶。A.2實(shí)驗(yàn)主要儀器蛋白電泳和電轉(zhuǎn)裝置。A.3實(shí)驗(yàn)步驟按如下操作步驟進(jìn)行：a)腦脊液中加入5×上樣緩沖液，100℃煮沸5min。b)常規(guī)制備15％分離膠和5％濃縮膠，常規(guī)上樣，使用濃縮膠80V，分離膠156V的電壓條件下電泳2h。200mA穩(wěn)流70min（濕式）或60mA60min（半干式）電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜。c)轉(zhuǎn)移完畢，膜用5％脫脂奶緩沖液（20mmol/LTris-HCl,pH7.5,0.15mmol/LNaCl,0.05％Tween20），1∶1000稀釋一抗（一抗為14-3-3蛋白特異性多克隆抗體），室溫振蕩孵育2h或4℃孵育過夜。緩沖液洗3次，共30min。d)與辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗兔IgG二抗（用緩沖液進(jìn)行1∶5000稀釋）37℃振蕩孵育1h。緩沖液洗3次，共30min。e)ECL顯色。A.4結(jié)果判定陽性對(duì)照采用羊腦組織勻漿液，或14-3-3陽性腦脊液；顯色后在30KD位置出現(xiàn)一條蛋白條帶，與陽性對(duì)照中蛋白條帶泳動(dòng)位置相同，即可判定為腦脊液中14-3-3陽性。6

9WS/T562—2017附錄B（規(guī)范性附錄）腦組織病理學(xué)檢測(cè)B.1中樞神經(jīng)組織分區(qū)采集中樞神經(jīng)組織分區(qū)采集包括以下五個(gè)步驟：a)除去硬腦膜，稱重。b)中樞神經(jīng)組織經(jīng)福爾馬林固定，固定最佳時(shí)間為10d～21d。c)腦組織。常規(guī)途徑及方法切腦、分區(qū)取材，分別記錄、標(biāo)記。d)脊髓。切開脊髓硬膜，分別記錄、標(biāo)記頸、胸、腰部脊髓組織塊。然后采集脊神經(jīng)根節(jié)。e)標(biāo)本感染性的清除。在進(jìn)一步檢測(cè)之前，所有的固定組織應(yīng)在96％以上的甲酸溶液中浸泡至少1h。需要注意的是，由于變性劑相互作用可產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)，任何事先經(jīng)過酚處理的組織都不能再進(jìn)行96％以上甲酸處理，故這些組織仍具有感染性。B.2標(biāo)本脫水、浸蠟脫水、浸蠟按下列程序進(jìn)行：70％乙醇1h18℃～20℃80％乙醇1h18℃～20℃90％乙醇1h18℃～20℃重復(fù)兩次無水乙醇2h18℃～20℃重復(fù)兩次二甲苯1h18℃～20℃重復(fù)兩次浸蠟1h58℃浸蠟1.5h58℃重復(fù)兩次B.3制片制片主要包括以下四步：a)組織標(biāo)本蠟塊的修塊、切片、制片按常規(guī)病理學(xué)方法進(jìn)行；b)如果組織蠟塊未經(jīng)96％甲酸處理，操作人員應(yīng)戴金屬網(wǎng)狀手套防護(hù)以免損傷；c)用于常規(guī)病理檢測(cè)和免疫組織化學(xué)檢測(cè)的腦組織片厚度為5μm；d)廢棄組織、蠟塊、碎片等收集后134℃高壓滅菌1h或焚燒。B.4HE染色HE染色按常規(guī)病理學(xué)方法進(jìn)行。B.5結(jié)果判定B.5.1sCJD、gCJD或fCJD、iCJD在大腦、小腦皮質(zhì)、皮質(zhì)下灰質(zhì)中出現(xiàn)海綿狀病變。7

10WS/T562—2017B.5.2vCJDSc丘腦后部大量星形膠質(zhì)細(xì)胞增生，神經(jīng)元丟失，即有大量的PrP沉積的海綿狀變性，特別是在大腦和小腦皮層灰質(zhì)區(qū)在淀粉樣斑塊周圍圍繞著一圈海綿狀空泡（花瓣樣）。B.5.3GSS很少或幾乎沒有海綿狀變性。B.5.4FFI顯著的丘腦神經(jīng)元丟失和膠質(zhì)增生，很少或幾乎沒有海綿狀變性。8

11WS/T562—2017附錄C（規(guī)范性附錄）Sc腦組織PrP的免疫組織化學(xué)檢測(cè)C.1原理ScCPrP具有抵抗變性劑、蛋白酶的水解作用，組織切片經(jīng)高壓水解、變性劑或蛋白酶處理破壞PrPSc后，以朊蛋白特異性抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，光學(xué)顯微鏡下觀測(cè)PrP蛋白沉積。C.2主要實(shí)驗(yàn)儀器光學(xué)顯微鏡。C.3實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)操作按如下順序進(jìn)行：a)組織切片置于56℃烘烤24h，常規(guī)脫蠟至水；b)取出后浸入水中5min，飽和苦味酸浸泡15min，除去福爾馬林色素；c)水洗3次，每次5min，除去苦味酸；d)3%過氧化氫/甲醇封閉15min～20min（阻斷內(nèi)源性過氧化物酶）；e)水洗3次，每次5min；f)高壓水解（121℃，雙蒸水）10min，或微波爐（高功率擋，雙蒸水）3次，每次5min；g)取出后室溫冷卻；h)在含量不小于96%的甲酸中浸泡5min～10min（石蠟包埋前未作甲酸處理的標(biāo)本）；i)水洗3次（緩慢水滴洗）；j)4mol/L異硫氰酸胍浸泡2h（4℃）；k)充分水洗；l)血清封閉1∶100稀釋的正常羊血清/磷酸鹽緩沖液（PBS）封閉20min；m)棄封閉液，加第一抗體（用1:100正常羊血清/PBS稀釋）孵育過夜，朊蛋白特異性單克隆抗體（如3F4），稀釋度為1:500～1:1000；n)PBS洗3次，每次5min；o)加第二抗體（用1:100正常羊血清/PBS稀釋）孵育30min，辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的抗兔抗體1:200稀釋，用于多克隆抗體檢測(cè)；或HRP標(biāo)記的抗小鼠抗體1:200稀釋，用于單克隆抗體檢測(cè)；p)PBS洗3次，每次5min；q)3,3'-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色后，充分水洗；r)蘇木素（輕微）復(fù)染；s)常規(guī)脫水、透明、封片。C.4結(jié)果觀察ScPrP蛋白陽性染色呈褐色，分布可呈散在型、斑塊型和混合型，細(xì)胞核呈淡藍(lán)色。9

12WS/T562—2017C.5結(jié)果判定C.5.1sCJD、iCJD、gCJD或fCJDSc具有PrP的沉積（斑塊型、彌漫性突觸型、斑塊/空泡周圍型）。C.5.2vCJDSc在細(xì)胞周圍和血管周圍出現(xiàn)無明確形態(tài)的PrP斑塊，特別是在小腦。C.5.3GSS可見特征性的淀粉樣斑塊沉積。C.5.4FFISc很少或幾乎沒有PrP的沉積。10

13WS/T562—2017附錄D（規(guī)范性附錄）Sc腦組織PrP的Westernblot檢測(cè)D.1原理ScPrP蛋白具有抵抗蛋白酶K水解且經(jīng)蛋白酶K消化后分子量變小的特點(diǎn)。提取腦組織蛋白，經(jīng)蛋白酶K水解后進(jìn)行SDS-PAGE電泳。蛋白電泳條帶電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜或尼龍膜，與PrP特異性單克隆抗體反應(yīng)。具有蛋白酶抗性的蛋白條帶顯色后，位置在17KD～27KD。D.2主要實(shí)驗(yàn)儀器包括以下幾種：a)組織研磨器；b)離心機(jī)；c)蛋白電泳/電轉(zhuǎn)裝置。D.3腦組織的提取和處理腦組織的研磨、提取應(yīng)在生物安全二級(jí)以上實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。操作人員需穿戴防護(hù)工作服、防護(hù)口罩、眼睛防護(hù)裝置、雙層手套、防護(hù)鞋套等。如果需要振蕩器，應(yīng)使用低功率擋；冰凍腦組織應(yīng)在生物安全柜內(nèi)解凍，切取少量組織（＜100mg＝放入凍存管，稱重；具體操作按如下順序進(jìn)行：a)按1∶10（m/V）比例加入適量的提取緩沖液，將組織轉(zhuǎn)移到組織研磨器，制備10%的腦組織勻漿。研磨器使用后在2mol/LNaOH或5％NaClO（20000μg/g游離氯）溶液中浸泡至少1h。b)腦組織勻漿轉(zhuǎn)移到凍存管，4℃，2000r/min離心，10min。c)收集上清液，-20℃保存。所有使用的試管、移液器頭浸入2mol/LNaOH或5％NaClO（20000μg/g游離氯）溶液中浸泡至少1h。D.4蛋白酶K水解及電泳、電轉(zhuǎn)按如下步驟操作：a)腦組織勻漿中加入終濃度20μg/mL的蛋白酶K，37℃作用1h～2h。b)加入等體積的2×上樣緩沖液，100℃煮沸10min。c)常規(guī)制備15％分離膠和5％濃縮膠。常規(guī)上樣，使用濃縮膠80V，分離膠156V的電壓條件下電泳2h。200mA穩(wěn)流70min（濕式）或60mA60min（半干式）電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜。D.5蛋白印跡反應(yīng)按如下步驟操作：a)轉(zhuǎn)膜完畢，膜用5％脫脂奶緩沖液（20mmol/LTris-HCl,pH7.5,0.15mmol/LNaCl,0.05％Tween20）溶液封閉過夜。b)與1∶8000稀釋的PrP特異性單克隆抗體（如3F4抗體），室溫振蕩孵育2h或4℃孵育過夜。緩沖液洗3次，共30min。11

14WS/T562—2017c)與辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗鼠IgG二抗（用緩沖液進(jìn)行1∶10000稀釋）室溫振蕩孵育2h。緩沖液洗3次，共30min。d)增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光顯色（ECL）溶液中顯色。D.6結(jié)果判定陽性對(duì)照采用羊瘙癢病毒株263K感染倉鼠腦組織提取物，或確診的CJD病人腦組織提取物。陰性對(duì)照為正常倉鼠腦組織提取物，或非CJD病人腦組織提取物。陽性、陰性對(duì)照的處理、蛋白酶K水解及蛋白印跡反應(yīng)按D.3、D.4、D.5進(jìn)行。腦組織提取物經(jīng)蛋白酶K水解后仍在17KD～27KD位置出現(xiàn)多條（一般為三條）顯色蛋白條帶，與未經(jīng)蛋白酶K消化的PrP蛋白顯色條帶（一般為三條，電泳遷移位置在30KD～35KD左右）相比，Sc蛋白酶處理的PrP顯色條帶的泳動(dòng)位置明顯下移。以此可判定腦組織中PrP蛋白呈陽性。12

15WS/T562—2017附錄E（規(guī)范性附錄）ScvCJD患者扁桃體PrP的Westernblot檢測(cè)E.1原理ScPrP蛋白具有抵抗蛋白酶K水解且經(jīng)蛋白酶K消化后分子量變小的特點(diǎn)。提取扁桃體活檢組織蛋白，經(jīng)蛋白酶K水解后進(jìn)行SDS-PAGE電泳。蛋白電泳條帶電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜或尼龍膜，與PrP特異性單克隆抗體反應(yīng)。具有蛋白酶抗性的蛋白條帶顯色后，位置在17KD～27KD。E.2主要實(shí)驗(yàn)儀器包括以下幾種：a)組織研磨器；b)離心機(jī)；c)蛋白電泳/電轉(zhuǎn)裝置。E.3扁桃體活檢組織的處理具體操作按如下順序進(jìn)行：a)按1∶10（m/V）比例加入適量的提取緩沖液，將扁桃體活檢組織轉(zhuǎn)移到組織研磨器，制備10%的組織勻漿。研磨器使用后在2mol/LNaOH或5％NaClO（20000μg/g游離氯）溶液中浸泡至少1h。b)扁桃體活檢組織勻漿轉(zhuǎn)移到凍存管，4℃，2000r／min離心，10min。c)收集上清液，-20℃保存。所有使用的試管、移液器頭浸入2mol/LNaOH或5％NaClO（20000μg/g游離氯）溶液中浸泡至少1h。E.4蛋白酶K水解及電泳、電轉(zhuǎn)按如下步驟操作：a)扁桃體活檢組織勻漿中加入終濃度20μg/mL的蛋白酶K，37℃作用1h～2h。b)加入等體積的2×上樣緩沖液，100℃煮沸10min。c)常規(guī)制備15％分離膠和5％濃縮膠。常規(guī)上樣，使用濃縮膠80V，分離膠156V的電壓條件下電泳2h。200mA穩(wěn)流70min（濕式）或60mA60min（半干式）電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜。E.5蛋白印跡反應(yīng)按如下步驟操作：a)轉(zhuǎn)膜完畢，硝酸纖維素膜用5％脫脂奶緩沖液（20mmol/LTris-HCl,pH7.5,0.15mmol/LNaCl,0.05％Tween20）溶液封閉過夜。b)與1∶8000稀釋的PrP特異性單克隆抗體（如3F4抗體），室溫振蕩孵育2h或4℃孵育過夜。緩沖液洗3次，共30min。13

16WS/T562—2017c)與辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗鼠IgG二抗（用緩沖液進(jìn)行1∶10000稀釋）室溫振蕩孵育2h。緩沖液洗3次，共30min。d)增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光顯色（ECL）溶液中顯色。E.6結(jié)果判定陽性對(duì)照采用羊瘙癢病毒株263K感染倉鼠腦組織提取物，或確診的CJD病人腦組織提取物。陰性對(duì)照為正常倉鼠腦組織提取物，或非CJD病人腦組織提取物。陽性、陰性對(duì)照的處理、蛋白酶K水解及蛋白印跡反應(yīng)按E.3、E.4、E.5進(jìn)行。扁桃體活檢組織提取物經(jīng)蛋白酶K水解后仍在17KD～27KD位置出現(xiàn)多條（一般為三條）顯色蛋白條帶，與未經(jīng)蛋白酶K消化的PrP蛋白顯色條帶（一般為三條，電泳遷移位置在30KD～35KD左右）相比，Sc蛋白酶處理的PrP顯色條帶的泳動(dòng)位置明顯下移。以此可判定扁桃體活檢組織中PrP蛋白呈陽性。扁桃體活檢不建議作為常規(guī)檢查，在腦電圖出現(xiàn)典型的三相波形后不應(yīng)進(jìn)行。對(duì)臨床表現(xiàn)與vCJD相似，以及MRI未出現(xiàn)雙側(cè)丘腦枕（后結(jié)節(jié)）高信號(hào)病例的診斷有意義。14

17WS/T562—2017附錄F（規(guī)范性附錄）ScvCJD患者扁桃體PrP的免疫組織化學(xué)檢測(cè)F.1原理ScCPrP具有抵抗變性劑、蛋白酶的水解作用，組織切片經(jīng)高壓水解、變性劑或蛋白酶處理破壞PrPSc后，以朊蛋白特異性抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，光學(xué)顯微鏡下觀測(cè)PrP蛋白沉積。F.2主要實(shí)驗(yàn)儀器光學(xué)顯微鏡。F.3實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)操作按如下順序進(jìn)行：a)扁桃體組織切片置于56℃烘烤24h，常規(guī)脫蠟至水；b)取出后浸入水中5min，飽和苦味酸浸泡15min，除去福爾馬林色素；c)水洗3次，每次5min，除去苦味酸；d)3%過氧化氫/甲醇封閉15min～20min（阻斷內(nèi)源性過氧化物酶）；e)水洗3次，每次5min；f)高壓水解（121℃，雙蒸水）10min，或微波爐（高功率擋，雙蒸水）3次，每次5min；g)取出后室溫冷卻；h)在含量不小于96%的甲酸中浸泡5min～10min（石蠟包埋前未作甲酸處理的標(biāo)本）；i)水洗3次（緩慢水滴洗）；j)4mol/L異硫氰酸胍浸泡2h（4℃）；k)充分水洗；l)血清封閉1∶100稀釋的正常羊血清/磷酸鹽緩沖液（PBS）封閉20min；m)棄封閉液，加第一抗體（用1∶100正常羊血清/PBS稀釋）孵育過夜，朊蛋白特異性單克隆抗體（如3F4），稀釋度為1∶500～1∶1000；n)PBS洗3次，每次5min；o)加第二抗體（用1∶100正常羊血清/PBS稀釋）孵育30min，辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的抗兔抗體1∶200稀釋，用于多克隆抗體檢測(cè)；或HRP標(biāo)記的抗小鼠抗體1∶200稀釋，用于單克隆抗體檢測(cè)；p)PBS洗3次，每次5min；q)3,3'-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色后，充分水洗；r)蘇木素（輕微）復(fù)染；s)常規(guī)脫水、透明、封片。F.4結(jié)果觀察及判定Sc光鏡觀察扁桃體活檢切片中PrP蛋白陽性染色呈褐色，分布可呈散在型、斑塊型和混合型，細(xì)胞核呈淡藍(lán)色。15

18WS/T562—2017扁桃體活檢不建議作為常規(guī)檢查，在腦電圖出現(xiàn)典型的三相波形后不應(yīng)進(jìn)行。對(duì)臨床表現(xiàn)與vCJD相似，以及MRI未出現(xiàn)雙側(cè)丘腦枕（后結(jié)節(jié)）高信號(hào)病例的診斷有意義。16

19WS/T562—2017附錄G（規(guī)范性附錄）PRNP基因序列、129位及219位氨基酸多態(tài)性檢測(cè)G.1血液樣品采集血液樣品采集注意事項(xiàng)如下：a)PRNP基因擴(kuò)增可以使用全血或白細(xì)胞。常用抗凝劑為檸檬酸，也可用其他抗凝劑如EDTA，肝素會(huì)對(duì)PCR反應(yīng)起抑制作用。b)血液樣品儲(chǔ)存應(yīng)為-70℃，在此條件下DNA樣品可長(zhǎng)期保存。c)PCR擴(kuò)增、血液樣品的處理和儲(chǔ)存應(yīng)在不同的實(shí)驗(yàn)室（空間）中進(jìn)行。G.2DNA的提取使用商品化DNA提取試劑盒或其他方法提取血液樣品DNA。在整個(gè)提取過程中都應(yīng)注意防止DNA污染；同時(shí)測(cè)定提取DNA的濃度。G.3PCRG.3.1PCR反應(yīng)前注意事項(xiàng)在整個(gè)PCR擴(kuò)增過程應(yīng)防止DNA污染，如試管、加樣吸頭、手套等。PCR反應(yīng)的操作應(yīng)嚴(yán)格按照四區(qū)劃分的原則進(jìn)行試劑分裝、核酸提取、PCR擴(kuò)增和核酸電泳（必要時(shí)）。G.3.2PCR引物PRNP基因PCR上下游引物如下：上游引物：5′-GGCAAACCTTGGATGCTGG-3′下游引物：5′-CCCACTATCAGGAAGATGAGG-3′標(biāo)準(zhǔn)PCR各種成分（50μL體積）DNA模板3μLPCR底物25μLPrP1-253上游引物1μLPrP1-253下游引物1μL雙蒸水20μL總體積50μLG.3.3標(biāo)準(zhǔn)PCR循環(huán)條件PRNP基因PCR擴(kuò)增條件：94℃5min（預(yù)變性）94℃55s（變性）55℃55s（退火）72℃55s（延伸）循環(huán)次數(shù)：30個(gè)。17

20WS/T562—2017G.3.4結(jié)果判定PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度：759bp。G.4常規(guī)基因序列測(cè)定按常規(guī)方法進(jìn)行基因序列測(cè)定。18

21WS/T562—2017附錄H（資料性附錄）遺傳或家族型人類朊病毒病PRNP基因突變位點(diǎn)H.1gCJD或fCJDD178N-129V、V180I、V180I+M232R、T183A、T188A、T188K、E196K、E200K、V203I、R208H、V210I、E211Q、M232R、R148H、4個(gè)額外八肽插入、5個(gè)額外八肽插入、6個(gè)額外八肽插入、7個(gè)額外八肽插入及2個(gè)八肽重復(fù)缺失。H.2GSSP102L、P105L、A117V、G131V、F198S、D202N、Q212P、Q217R、M232T及8個(gè)額外八肽插入。H.3FFID178N-129MM。H.4未分類的遺傳或家族型人類朊病毒病密碼子點(diǎn)突變：H187R，216八肽重復(fù)區(qū)（9個(gè)額外八肽）插入。19

22WS/T562—2017附錄I（資料性附錄）克-雅病的鑒別診斷I.1病毒性腦炎尤其是單純皰疹病毒性腦炎，病人常表現(xiàn)為精神癥狀、癲癇、發(fā)燒、認(rèn)知障礙及頭痛。起病急，進(jìn)展迅速。病變常位于顳葉內(nèi)側(cè)，也可累及額葉，DWI較T2WI發(fā)現(xiàn)病變更敏感，部分影像學(xué)表現(xiàn)與CJD類似，但前者常有腦實(shí)質(zhì)的壞死、出血，腰穿顯示腦脊液壓力增高，白細(xì)胞和蛋白輕度增高等，根據(jù)臨床病史、腦脊液檢查及影像學(xué)表現(xiàn)可予以鑒別。I.2橋本腦病可分為：血管炎型，表現(xiàn)為反復(fù)的卒中樣發(fā)作如一過性神經(jīng)功能缺損、失語、癲癇或急性意識(shí)障礙；緩慢進(jìn)展型，隱襲起病，早期表現(xiàn)為意識(shí)模糊、焦慮或癡呆。無局灶性神經(jīng)功能缺損的體征，但神經(jīng)心理測(cè)試常提示嚴(yán)重的認(rèn)知功能障礙。兩種類型均可出現(xiàn)癲癇發(fā)作、肌陣攣、震顫、昏迷、錐體外系癥狀及小腦性共濟(jì)失調(diào)。特征是血清抗甲狀腺球蛋白（antithyroglobulin）抗體（TGAb）或抗甲狀腺過氧化物酶（antimicrosomal）抗體（TMAb）的增高，皮質(zhì)激素治療有效。I.3線粒體腦病主要為MELAS型(線粒體腦病伴乳酸中毒及卒中樣發(fā)作)，為線粒體DNA突變所致，臨床上可引起亞急性癡呆需與CJD鑒別，患者常有卒中發(fā)作、癲癇和偏頭痛，可有癡呆、乳酸中毒等癥狀。DWI上可顯示皮層異常高信號(hào)，T2WI及FLAIR上顯示腦回明顯腫脹以及層狀壞死，此征象不符合CJD表現(xiàn)。I.4阿爾茨海默病潛隱起病，早期出現(xiàn)記憶力障礙，病程進(jìn)展較緩慢，臨床上以智能損害為主，伴有精神及行為改變，輔助檢查中無CJD典型的腦電圖，頭顱MRI顯示以雙側(cè)海馬更為突出的腦萎縮改變，腦脊液14-3-3蛋白陰性。I.5血管性癡呆主要臨床表現(xiàn)為與血管事件相關(guān)的、階梯性進(jìn)展的癡呆，但頭顱MRI可見多發(fā)性腦梗死以及白質(zhì)疏松。I.6中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤及其他腦腫瘤均可表現(xiàn)急、慢性癡呆，但頭顱MRI的占位性病變可資鑒別。I.7皮層靜脈血栓形成20

23WS/T562—2017一些疾病可引起靜脈血栓性腦病。如硬腦膜動(dòng)靜脈瘺可引起臨床上可逆性癡呆，常有顱內(nèi)壓增高出血、頭痛、癲癇等，但臨床癥狀為非特異性。MRDWI也可表現(xiàn)有與CJD類似的皮層高信號(hào)，腦血管造影檢查可與之鑒別。I.8副腫瘤性亞急性小腦變性特點(diǎn)是亞急性、進(jìn)行性、雙側(cè)性小腦功能障礙，可伴有癡呆。早期頭顱MRI正常，晚期表現(xiàn)小腦萎縮。常見腦脊液淋巴細(xì)胞增多、蛋白含量高，常見于肺癌或女性生殖系統(tǒng)腫瘤患者。21

24WS/T562—2017參考文獻(xiàn)[1]CDC’sDiagnosticCriteriaforCreutzfeldt-JakobDisease(CJD)，USA，2010.[2]NationalCreutzfeldt-JakobDiseasesurveillanceDiagnosticCriteria，UK，2010.[3]WorldHealthOrganization.WHOmanualforsurveillanceofhumantransmissiblespongiformencephalopathiesincludingvariantCreutzfeldt-Jakobdisease，CommunicableDiseaseSurveillanceandResponse，2003._________________________________22