peptide pull down 方案譯文

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1、PeptidePull-down方案設(shè)計(jì)好的備用肽段(C端末尾加幾個(gè)殘基作為連接臂并且末端偶聯(lián)生物素,)應(yīng)被色譜純化至純度大于80%,等分,凍干,干燥環(huán)境下于—80度儲(chǔ)存1連接肽段的珠子的制備:(注意,制備的所有步驟都應(yīng)在冰上或最多4度的環(huán)境下進(jìn)行)1用1mL磷酸鹽緩沖液加0.1%的表面活性劑TritonX-100,沖洗400微升的親和素珠(離心?(microcentrifuge),500RCF,30s)移去上清液,至少洗三次(洗去表面的保護(hù)劑,表面活性劑TritonX-100也促使疏水性的珠子與水相分離,否則無(wú)法得到上清液)制備兩個(gè)40

2、0μL的珠子,其中一份不偶聯(lián)肽段作為只有珠子的對(duì)照組。用裝有毛細(xì)管凝膠的移液器尖端來(lái)取上清液,從而避免移去珠子2使100微克偶聯(lián)生物素的肽段重新懸浮在400微升磷酸鹽緩沖液(PBS)中這些肽段的量足夠配400μL偶聯(lián)肽段的珠子,做20次pull—down,如果珠子有著不同的連接生物素能力,注意將肽段和親和素比例調(diào)整合適3將2中制備好的400微升重新懸浮的肽段加入400微升洗過(guò)的珠子中,旋轉(zhuǎn)(rotation),在室溫下溫育3到5h也可在4度過(guò)夜溫育4用1mLPBS+0.1%TritonX-100沖洗連接了肽段的珠子至少三次,來(lái)移除未連接上

3、的肽段5將偶聯(lián)了肽的珠子重新懸浮在400微升磷酸鹽緩沖液中來(lái)制備50%的懸浮液,在4度下儲(chǔ)存若長(zhǎng)期儲(chǔ)存,加疊氮化鈉到濃度為0.1%,4度下至少可儲(chǔ)存1個(gè)月。甲基化修飾穩(wěn)定,磷酸化修飾不穩(wěn)定2用固定好的肽段從復(fù)雜混合物中釣蛋白一些一般原則:1在實(shí)驗(yàn)的每一步中都要確保蛋白酶抑制劑的使用,防止蛋白的降解。2都應(yīng)在冰上或最多4度的環(huán)境下進(jìn)行。3必須加未偶聯(lián)肽的珠子作為陰性對(duì)照。4除HEPES緩沖液外在這次試驗(yàn)中也可使用其他緩沖液5所有肽段平行處理制備蛋白質(zhì)的復(fù)雜混合物1每次實(shí)驗(yàn)從108數(shù)量級(jí)的細(xì)胞(問(wèn)題:細(xì)胞培養(yǎng))中制備新鮮核提取物,采用標(biāo)準(zhǔn)的高

4、鹽溶液提取方案總量108數(shù)量級(jí)的細(xì)胞一般來(lái)說(shuō)基本足夠了,最好用新鮮核提取物防止蛋白降解,不過(guò)提取物可先快凍在液氮中再在-80°C儲(chǔ)存,從不同細(xì)胞系中提取是很重要的,因?yàn)橛行┑鞍自诮o定的細(xì)胞中表達(dá)的不是很好,此外考慮到所感興趣的組蛋白翻譯后修飾所涉及的細(xì)胞有絲分裂過(guò)程,與修飾同步的,正進(jìn)行有絲分裂的細(xì)胞的核提取物是合適的,一些組蛋白連接的蛋白因子在420mM濃度的鹽溶液提取過(guò)程中不能被有效提?。ū热缒切┖腿旧|(zhì)連接很牢固的,這時(shí)就要考慮其他提取組蛋白方法了,比如用DNA水解酶或微球菌核酸酶來(lái)使組蛋白溶解)2調(diào)整提取物的鹽濃度到150毫摩每升

5、:利用KCl鹽濃度為150毫摩每升的緩沖液D透析或利用無(wú)鹽緩沖液bufferD稀釋,調(diào)整體積到每毫升108當(dāng)量細(xì)胞,(總蛋白濃度約為2.5μg/μL)向bufferD加入新制的DTT,PMSF,蛋白酶抑制劑是很重要的3添加表面活性劑TritonX-100到提取物中使得TritonX-100濃度為0.1%TritonX-100對(duì)防止pulldown過(guò)程中蛋白的非特異性連接很重要4最大速度(13200RCF)離心15到30min,清除所有沉淀,轉(zhuǎn)移上清液到干凈試管中4°C下我們用13200轉(zhuǎn)每分的臺(tái)式離心機(jī),等待一段時(shí)間來(lái)確保所有的可見沉淀都

6、被從核提取物中清出,徹底移去所有沉淀是非常重要的,會(huì)顯著減少非特異性連接的背景水平復(fù)雜混合物與珠子的處理5每份將80μL(50%)的未偶聯(lián)的珠子溶液(含40μL珠子),離心使成團(tuán)(500RCF,30s),移除上清液6用500μLBufferD(含濃度為150mM的KCl)將珠子至少洗一次(500RCF,30s,移去上清液,避免移走珠子)7將制備的核提取物加到洗過(guò)的珠子中,在4度下輕輕旋轉(zhuǎn)(rotation)溫育30分鐘若方便可以增加溫育時(shí)間,然而預(yù)清理時(shí)間在超過(guò)30分后,我們?cè)贈(zèng)]能觀察到非特異性連接蛋白背景水平的下降。而且請(qǐng)記住這步不能從

7、數(shù)量上減少非特異性連接的水平(只作為對(duì)照組)8通過(guò)離心30秒使珠子集聚成團(tuán)狀(離心力調(diào)整為500RCF),用干凈試管收集上清液來(lái)用于pulldown如果需要的話,再離心除去任何殘余珠子9取15uL清澈的核提取物作為input對(duì)照組用于之后的分析偶聯(lián)肽段珠子的準(zhǔn)備10每份取40uL,50%的珠子懸浮液(含20uL珠子)偶聯(lián)肽段的珠子的量可以根據(jù)蛋白與它結(jié)合的親和力的強(qiáng)弱來(lái)調(diào)整,然而我們也發(fā)現(xiàn)當(dāng)珠子體積超過(guò)20uL只能增加背景干擾水平,不能增加特異性連接11離心使珠子集聚成團(tuán)狀,移除所有上清液,保證每份有著大致相同量的珠子通過(guò)離心30秒使珠子

8、集聚成團(tuán)狀(離心力調(diào)整為500RCF),用裝毛細(xì)管凝膠的移液管吸頭移去上清液,,在每次pulldown試驗(yàn)中確保使用大致相同的已偶聯(lián)肽段的珠子是很重要的,確保不同肽段之間能進(jìn)行比較12用500

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