07生技074120304劉治敏畢業(yè)論文

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1、重組木聚糖酶XynAHJ3的酶學(xué)性質(zhì)研究姓名:劉治敏  專業(yè):生物技術(shù)指導(dǎo)教師:李俊俊摘要:本文主要介紹重組木聚糖酶XynAHJ3的酶學(xué)性質(zhì)以及應(yīng)用。結(jié)果表明:該木聚糖酶XynAHJ3的最適反應(yīng)溫度為70℃,在20℃和80℃下都具有酶活性;60℃下XynAHJ3的半衰期60min,70℃下很快失活;酶反應(yīng)最適反應(yīng)pH為6.0,在pH12.0時仍具有25%以上的酶活;經(jīng)pH4.0–11.0的緩沖液處理1h,酶活剩余90%以上;10mM的Ag+和Hg2+可完全抑制XynAHJ3;Fe3+、Cu2+、Mn2+、Pb2+及10%(v/v)乙醇對XynA

2、HJ3的抑制較強;Zn2+、Co2+及Fe2+對XynAHJ3的抑制較弱(剩余酶活>60%);β-mercaptoethanol可使XynAHJ3的酶活提高~0.3倍;其余金屬離子和化學(xué)試劑對XynAHJ3的影響很小,10mM及100mM的SDS未能使XynAHJ3失活。關(guān)鍵詞:木聚糖酶;酶學(xué)性質(zhì);酶活前言:木聚糖是一種多聚五碳糖,是植物細胞中主要的半纖維素成分。木聚糖酶是可將木聚糖降解成低聚木糖和木糖的水解酶。一個木聚糖分子的完全酶解需要幾步酶促反應(yīng),其中作用于主鏈的酶有兩種:β-1,4-木聚糖酶和β-木糖苷酶。一般而言,前者從主鏈內(nèi)部作用于

3、木糖苷鍵,將木聚糖分解成低聚木糖,而后者則作用于低聚木糖的末端,釋放出木糖[1]。對木聚糖酶的研究早在60年代就已開始,已經(jīng)從不同來源的微生物中分離到大量的不同類型不同性質(zhì)的木聚糖酶[2]。木聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)決定了其在應(yīng)用上的潛力及應(yīng)用領(lǐng)域,一般要求木聚糖酶有較高的催化效率、較好的抗逆性、較廣的pH和溫度適應(yīng)范圍等。近年來,大量有關(guān)木聚糖酶結(jié)構(gòu)與功能的研究不斷展開,一方面加深了對木聚糖酶作用的分子機理的了解,另一方面為通過基因工程和蛋白質(zhì)工程改良木聚糖酶的性質(zhì)、研制出符合不同應(yīng)用領(lǐng)域要求的木聚糖酶產(chǎn)品提供了指導(dǎo)。現(xiàn)在已知能夠產(chǎn)生木聚糖酶的菌種包

4、括細菌、真菌、黑曲酶、木霉等,不同來源的木聚糖酶的催化特性是有差異的,有不同的最適pH和最適作用溫度,金屬離子對不同來源的木聚糖酶活性的影響各不相同[3-4-5]。從產(chǎn)木聚糖酶的菌種的篩選,目的基因的提取以及轉(zhuǎn)入大腸桿菌中表達,用IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)酶,酶的提純,最后進行酶學(xué)性質(zhì)的測定,其一序列的流程目的是為了獲得木聚糖酶的高產(chǎn)菌株,有望應(yīng)用于食品及飼料等產(chǎn)業(yè),為更好的服務(wù)社會。對實驗室木聚糖酶XynAHJ3整個獲取流程有一定的了解,本文重點是對其酶學(xué)性質(zhì)的研究。91實驗材料1.1菌株菌種:Lechevalieriasp.HJ3,實驗室保存表達載體:

5、pET28a(+),表達菌株:大腸桿菌BL21(DE3)工程菌:實驗室已前期構(gòu)建1.2培養(yǎng)基LB:1%tryptone,0.5%yeastextract,1%NaCl。121℃高壓滅菌30min。1.3試劑配制(1)DNS溶液:稱取6.3g3,5-二硝基水楊酸和262mL2mol/L的NaOH,加到500mL含有182g酒石酸鉀鈉的熱水溶液中,再加5g重蒸酚和5g亞硫酸鈉于其中,攪拌溶解,冷卻后定容到入1000mL,溶液為黃色,室溫存放在棕色瓶中,至少一周后方可使用。(2)D(+)-木糖溶液:lg木糖溶解于pH值為7.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖

6、液上述中,定容至100mL,室溫下保存。(3)0.05mol/L檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(4)0.05mol/LTris-HCl緩沖液(5)O.05mol/LGly-NaOH緩沖液(6)0.5%木聚糖底物溶液:2.5g樺木木聚糖溶解于pH值為7.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中,定容至500mL,室溫下保存。(7)10mM的金屬離子化合物、螯合劑(EDTA)和表面活性劑(SDS)(水對照)的緩沖液。1.4實驗儀器型號生產(chǎn)廠家(1)分析天平PL203梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司(2)離心機Centrifuge5418德國eppendorf公司

7、(3)高速冷凍離心機Centrifuge5810R德國eppendorf公司(4)分子水浴鍋HAAKEDC10德國HAAKE公司(5)滅菌鍋TDGC2-3天正集團有限公司(6)振蕩器(7)pH儀(8)分光光度計(9)移液槍,錐形瓶,容量瓶,試管若干92實驗方法2.1重組木聚糖酶XynAHJ3酶活力測定木聚糖酶在一定條件(pH7.0,37℃)下,催化水解底物木聚糖生成木糖等還原糖,還原糖又同DNS試劑發(fā)生顯色反應(yīng),用分光光度計測定其吸光度,計算酶活力。酶活力單位定義:在37℃,pH7.0條件下,每mL待測酶液每min催化底物生成1μmol木糖所需

8、的酶量為一個酶活力單位(U)。(1)木糖標準曲線的繪制分別吸取l0mmol/ml木糖標準液0、25、50、100、150、200μl,放于六只帶塞的磨

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