西瓜抗病基因同源序列的克隆與分析

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1、西瓜抗病基因同源序列的克隆與分析奚玉培，謝新蕊，高?強(qiáng)，張志忠（福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建福州350002）摘?要：以植物絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶類(STK)抗病基因產(chǎn)物催化結(jié)構(gòu)域Ⅰ的保守氨基酸序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，以西瓜基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到大約500bp的目的條帶。重組質(zhì)粒經(jīng)PCR檢測(cè)后進(jìn)行測(cè)序，獲得1個(gè)有效序列，可以編碼完整的氨基酸序列。同源性分析表明其具有STK保守結(jié)構(gòu)域，與已經(jīng)克隆的Pto、Lr10和Lectin等基因在氨基酸水平上的同源性為40.0%～54.0%。關(guān)鍵詞：西瓜；抗病

2、基因同源序列；絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(STK)西瓜[Citrulluslanatus…(Thunb.)]栽培歷史悠久，分布物：R1：5'-TTC/TGGIA/G/TIIGTITAC/TA/CA/GIGG-廣泛，經(jīng)濟(jì)價(jià)值巨大。據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)統(tǒng)計(jì)是世3';R2：5'-AC/TICCA/GA/TAAIC/G…A/TA/GTAIAC/[1]界第五大果品，我國(guó)是西瓜最大的栽培和消費(fèi)國(guó)。近年來(lái)TA…/GTC-3'。以西瓜基因組DNA為PCR擴(kuò)增模板，反西瓜栽培連作現(xiàn)象日趨嚴(yán)重，病害逐年加重，產(chǎn)量和品質(zhì)下

3、應(yīng)體積25…μL，內(nèi)含2.5…μL…10×Ex…Taq酶緩沖液，2μL…降，經(jīng)濟(jì)損失巨大。目前控制病害的主要措施是嫁接和化學(xué)dNTP(2.5…mmol/L)，引物1和引物2(10…mmol/L)各0.5…μL，防治，嫁接會(huì)對(duì)品質(zhì)產(chǎn)生一定影響，同時(shí)需不斷篩選砧木，0.5μL…Ex…Taq…DNA聚合酶。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性…而農(nóng)藥使用易引起病源抗藥性并污染環(huán)境，在高溫高濕地區(qū)5…min，此后進(jìn)行94℃30…s、45℃40…s、72℃1…min的35個(gè)防治效果不佳。培育抗病性強(qiáng)的新品種是解決這一問(wèn)題的最循

4、環(huán)，72℃延伸10…min。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)回收目的片段，根本措施，但西瓜遺傳基礎(chǔ)狹窄，抗病資源缺乏，抗病性遺連接pMD18-T載體，測(cè)序。[2]1.2.3?西瓜RGAs生物信息學(xué)分析?西瓜RGAs生物信息傳規(guī)律復(fù)雜，常規(guī)抗病育種進(jìn)展緩慢。利用植物抗病基因工程技術(shù)有望解決這一問(wèn)題，其首選的最佳目的基因是來(lái)自學(xué)分析利用DNAMAN…6.0和Blast進(jìn)行。[3]植物自身的抗病基因(R基因)?，F(xiàn)已克隆到玉米、番茄、2?結(jié)果與分析煙草等植物的有關(guān)抗病基因。一旦分離克隆到R基因，就2.1?西瓜RGAs的獲得

5、可把它導(dǎo)入其他品種或植物中獲得對(duì)特定病原菌的抗性。西試驗(yàn)中以西瓜基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到瓜R基因克隆工作起步較晚，目前只克隆到1個(gè)和枯萎病1條大約500…bp的條帶(見圖1)。目的條帶回收后連接入抗性相關(guān)的基因Fom-2，對(duì)枯萎病原菌0和1型生理小種有載體，隨機(jī)選擇15個(gè)經(jīng)PCR檢測(cè)的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，[4,5]?；剐裕渌共」δ芑虻目寺∩形匆妶?bào)道。本試獲得3條有效序列，經(jīng)DNAMAN軟件分析其中1條可以驗(yàn)根據(jù)在其他植物中已有報(bào)道的R基因中STK類保守結(jié)構(gòu)編碼完整氨基酸序列。域設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并

6、引物，克隆西瓜抗病基因同源序列(RGAs)，有望從中篩選出和西瓜抗病緊密相關(guān)的基因，為利用抗病基因工程改良西瓜提供理論依據(jù)和基因來(lái)源。1?材料與方法1.1?材料以西瓜品種‘新紅寶’(Cucumismelocv.’XinHongBao’)葉片為材料。1.2?方法1.2.1?西瓜基因組DNA的提取?西瓜基因組DNA提取采[6]用CTAB法。圖1　STK類R基因簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增西瓜基因組DNA產(chǎn)物1.2.2?西瓜RGAs的克隆?根據(jù)目前已克隆的STK類R基2.2?西瓜RGAs的比較和聚類分析因產(chǎn)物的催化結(jié)構(gòu)域Ⅰ和

7、Ⅸ的保守氨基酸序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引Blast初步分析顯示序列具有ATP結(jié)合部位、底物結(jié)合部位和激酶結(jié)構(gòu)域的活化環(huán)(A-loop)等，屬于典型的蛋白激酶基因家族，可能是STK蛋白激酶類R基因同源第一作者簡(jiǎn)介：奚玉培（1987－），女，碩士研究生；研究方向序列片段。將獲得的西瓜RGAs序列與目前具有代表性的為蔬菜遺傳育種與生物技術(shù)。STK類R基因番茄抗假單孢菌基因Pto(U59316)、小麥抗通訊作者：張志忠，副教授。E-mail:zeada2001@163.com。葉銹病基因Lr10(U51330)和擬南芥外源

8、凝集素蛋白激酶類項(xiàng)目來(lái)源：福建省自然科學(xué)基金“西瓜一號(hào)染色體分子標(biāo)記篩選基因Lectin(AB017067)的氨基酸序列進(jìn)行同源性分析，均和R基因的克隆”(2011J01083)。含有STK類R基因的9個(gè)保守結(jié)構(gòu)域(見圖2)，為STK-32-中國(guó)園藝文摘?2013年第12期類候選抗病基因類序列，同源性在40.0%～54.0%之間。3?討論由R基因控制的防衛(wèi)機(jī)制已經(jīng)成為廣泛研究的重點(diǎn)。大多數(shù)已報(bào)道的R基因氨基酸序列存在很多保守區(qū)域，如[7]L