寡核苷酸圖譜分析

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1、寡核苷酸圖譜分析?????寡核苷酸圖譜分析是指核酸或核酸片段經(jīng)T1核酸酶切割后電泳，少數(shù)較大分子量的酶切核酸片段在聚丙烯酰胺凝膠上分布特點的比較。因為它是通過少數(shù)核酸片段來了解整個核酸的特征，如同根據(jù)指紋特點判斷案情一樣，因此又稱為指紋圖分析(Analysisoffingerprintmap)。該法最大優(yōu)點為比較簡便，敏感性高，能顯示出核酸間細小的差別，但缺點是無法對差別大的兩條來源不同的核酸進行比較。目前該種方法已在病毒學(xué)研究中得到了廣泛的應(yīng)用，特別是對RNA病毒分類、鑒定病毒遺傳變異等，在流行病學(xué)調(diào)查中具有重要意義。

2、(一)原理　提純后的病毒核酸，通過適當?shù)拿盖?，可產(chǎn)生大小不同的片段，經(jīng)放射性同位素標記(或在病毒培養(yǎng)時標記)后，進行垂直雙相電泳，再經(jīng)放射自顯影，可得到特征性的圖譜，即寡核苷酸指紋圖譜。所用的酶一般是T1核糖核酸酶，這種酶是一種RNA限制酶，特異性地作用于鳥嘌呤核苷酸的3’磷酸基團，切割與其鄰近核苷酸相連的5’磷酯鍵，最終產(chǎn)物為帶3’磷酸鳥嘌呤末端的寡核苷酸，即每斷片的3’末端為鳥嘌呤并帶有磷酸，而5’末端就暴露出羥基團。然后在T4多核苷酸激酶的作用下，用32P－ATP標記寡核苷酸的5’末端，最后用飽和酚和酵母RNA混合

3、液終止激酶的作用。在pH3.5條件下，從上到下進行第一相電泳，依片段所帶電荷的不同將其分開，其后在pH8.2條件下，從右到左進行第二相電泳，可根據(jù)片段長短的不同將其分開，通過自顯影，便可在底片上看到片段的位置和數(shù)目，借此對不同的病毒株的核酸進行分析比較。在電泳中一般采用兩種指示劑：一種為溴酚藍(BPB)，它的大小相當于8-10個核苷酸，在pH3.5時呈綠色，在pH8.2時呈藍色；另一種為聯(lián)苯胺(XyleneCyanol，簡稱XC)，其大小相當于25個核苷酸，在pH3.5時為藍色，pH8.2時為綠色，它周圍的點為重點觀察區(qū)

4、。由于12-14個堿基以上的核苷酸片段特異性高，太短的片段特異性低，因此，圖譜上部的斑點由于片段較小難以進行分析，多取圖譜下端或整個圖的下1/3處斑點進行比較，一般取50-70個斑點。(二)基本方法　1.病毒的增殖與核酸的提純　用適當?shù)慕M織培養(yǎng)細胞繁殖病毒，有些病毒也可用雞胚進行繁殖，以飽和酚法提純病毒核酸。2.核糖核酸酶切和同位素標記　常用的酶是T1核糖核酸酶(故該技術(shù)又稱為T1－寡核苷酸指紋圖譜)，將該酶與病毒RNA以一定比例混合，置37℃消化30-40分鐘。經(jīng)消化后的核酸變?yōu)榇笮〔坏鹊钠?，片段的大小與鳥苷酸的含量

5、有關(guān)。消化步驟為：于Eppendorf管中加入1?l去離子水，加1?g病毒RNA，加1?l2倍濃縮的消化緩沖液(40mmol/LpH7.5Tris-HCl，2mmol/LEDTA)，置沸水中煮60-90秒，快速置冰浴中冷卻，加入2?lT1酶(5IU/?l)，混合后置37℃水浴30-40分鐘。標記的方法有兩種：一是內(nèi)標記，即在病毒培養(yǎng)液中加入32P－正磷酸鹽或32P－ATP，使增殖的病毒中帶有32P。另一種方法是外標記(又稱末端標記)，在經(jīng)過消化后的核酸片段中加入32P-ATP和T4多核苷酸激酶，以標記片段5’端。外標記方

6、法為：于上述酶消化溶液中加入35?l激酶緩沖液(10mmol/LTris－HCl，10mmol/LMg(OAC)2，1mmol/LDTT)，1?lT4多核苷酸激酶，10?l32P-ATP(比活性5000Ci/mmol)，混合后置37℃水浴30分鐘。3.反應(yīng)終止及寡核苷酸的提取　于上述反應(yīng)物中加入100?lTSE飽和酚，混合，再加入中止混合物(用0.6mol/L醋酸氨配成2mg/ml的酵母RNA)終止激酶作用。pH7.8的TSE緩沖液：Tris2.42g最終濃度0.02mol/LNaCl8.77g最終濃度0.15mol/L

7、EDTA(Na2)0.74g最終濃度0.002mol/L用1NHCl(約12ml)調(diào)pH至7.8，補無離子水至1000ml，高壓消毒。將上述終止后的溶液，輕搖混合后，11000r/min離心3分鐘，取上層水相，加入2.5倍冷無水乙醇，混合置-20℃過夜或-70℃30分鐘，用12000r/min離心15分鐘，棄上清，干燥沉淀物(即核酸)。4.電泳及自顯影指示染料的配制：以10ml為例溴酚蘭10mg終濃度：0.1％聯(lián)苯胺10mg0.1％尿?素3.6g6mol/L蔗?糖1g?10％(W/V)EDTA2mg50mmol/L酵母R

8、NA100mg10mg/ml加無離子水至10ml?(1)第Ⅰ相電泳　將玻璃板(20×39cm)及梳子清洗干凈，用10％丙烯酰胺，0.325％甲叉雙丙烯酰胺注膠，電泳緩沖液為25mmol/L檸檬酸，6mol/L尿素，pH3.5。待凝膠凝聚后，進行垂直式電泳，方向為從上到下，在4℃預(yù)電泳30-60分鐘后，將制備好的干燥核