三磷酸腺苷、二磷酸腺苷和一磷酸腺苷的毛細(xì)管電泳分析研究

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1、A57三磷酸腺苷、二磷酸腺苷和一磷酸腺苷的毛細(xì)管電泳分析研究周春喜郁榮呂海燕廖杰(解放軍總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)測(cè)試中心，北京100853)摘要：考察了三磷酸腺苷，二磷酸腺苷和一磷酸腺苷在毛細(xì)管電泳中的分離行為，研究了運(yùn)行緩沖液的pH值、磷酸鹽濃度，分離電壓、分離溫度等因素對(duì)這3種化合物的遷移時(shí)間和分離效果的影響．結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些因素對(duì)上述3種化合物的分離有顯著的影響。優(yōu)化后的分離條件：運(yùn)行緩沖液為25mfflOl，L磷酸鹽(pH7．o)，分離電壓為15kV，分離溫度為25"C．三種物質(zhì)在10分鐘內(nèi)全部出峰，方法的檢出限為0．12

2、5切g(shù)／n1L，線(xiàn)性范圍為0．125m咖L一2．0mg,'mL，相關(guān)系數(shù)為0．99l一0．997。關(guān)鍵詞：毛細(xì)管電泳：ATP；ADP；AMP三磷酸腺苷(ATP)是機(jī)體的能量來(lái)源，在細(xì)胞的代謝活動(dòng)中占有重要地位。腺苷酸池(A1咿+ADP+AMP)水平是描述細(xì)胞代謝的重要參數(shù)之一，測(cè)定組織中的腺苷酸含量具有重要意義。其測(cè)定方法主要為高效液相色譜法[1]，需耗用大量有機(jī)溶劑，費(fèi)用高．且對(duì)環(huán)境有污染。本文研究了ATP、ADP及AMP在毛細(xì)管電泳中的遷移行為，并對(duì)其分析條件進(jìn)行了優(yōu)化。1實(shí)驗(yàn)部分f．1儀器與試耕P／ACEMDQ型

3、毛細(xì)管電泳儀帶二極管陣列檢測(cè)器(美國(guó)Beckman-Coulter公司)；未涂漬石英毛細(xì)管柱50umi．d．X50cm(有效長(zhǎng)度40cm)(河北永年光纖廠)。ATP，ADP、AMP、磷酸二氫鈉，磷酸氫二鈉、磷酸鈉、氫氧化鈉等為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?。所有緩沖液均以重蒸去離子水配制，并經(jīng)0．45pm濾膜過(guò)濾。T．2操作步驟按要求配制緩沖液。采用壓力進(jìn)樣方式(34kPa×5s)，正極進(jìn)樣，負(fù)極檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)254mn。每次進(jìn)樣前將毛細(xì)管柱依次用水、O．1mol／LNaOH、水、緩沖液各沖洗3rain。2結(jié)果與討論2．1緩沖液的pH

4、值對(duì)分離的影響以濃度為100mmd／L，pH值分別為II．0，10．0。9．0，8．0，7．0及6．0的磷酸鹽緩沖液為分離介質(zhì)進(jìn)行分離。發(fā)現(xiàn)在pH值為6．0—1I．O的范圍內(nèi)，所有峰均可基線(xiàn)分離．但遷移時(shí)間以pH值為7．0時(shí)為最短。這是由于當(dāng)pH大于6時(shí)，管壁硅羥基的電高趨于飽和，電滲流變化平緩[2]，pH值的升高會(huì)顯著地降低化合物的遷移速率。pH值的升高主要有兩方面的作用：一是增大了水相的離子強(qiáng)度，降低了化合物的淌度；二是增大了這些化合物的電離度。使其負(fù)電荷密度增高。2．2緩沖液中磷酸鹽的濃度對(duì)分離的影響以pH值為7

5、．0．濃度分別為25mmol／L，50mmol／L和100mmol／L的磷酸鹽為分離介質(zhì)，發(fā)現(xiàn)磷酸鹽濃度升高時(shí)，遷移時(shí)間延長(zhǎng)。這是由于磷酸鹽濃度的增高增大了水相的離子強(qiáng)度而改變了化合物的淌度。磷酸鹽的濃度在25mmol／L一100mmol／L的范圍內(nèi)．所有的峰均可基線(xiàn)分離。當(dāng)磷酸鹽的濃度為25mraol／L時(shí)遷移時(shí)間晟短。2．3分離電壓對(duì)分離的影響用25mmol／L，pH7．0的磷酸鹽緩沖液．采用不同的分離電壓(分別為10kV，15kV，20kV和25kV)進(jìn)行分離。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，電壓增大時(shí)，遷移時(shí)間隨之縮短，相鄰峰的分辨

6、率以15kV時(shí)為最大。電場(chǎng)強(qiáng)度的增大．使電滲流增大，遷移時(shí)間縮短，分離度增大；但場(chǎng)強(qiáng)過(guò)高時(shí)，焦耳熱弓f起的峰擴(kuò)展也更加明顯。2．4分離溫度對(duì)分離的影響固定其它條件。觀察分離溫度(15℃，25℃，35"C，45"C和55"C)對(duì)遷移時(shí)間和分離效果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)溫度升高時(shí)，遷移時(shí)間縮短，相鄰峰的分辨率以15℃時(shí)為最大，這是因?yàn)闇囟鹊纳呤谷芤旱恼硿禂?shù)降低，溶質(zhì)的擴(kuò)散加快。從方便儀器操作的角度考慮，選擇分析效果較好而又接近室溫的25℃。。2．5重復(fù)性與線(xiàn)性關(guān)系考察遷移時(shí)間的日內(nèi)及日問(wèn)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為1．7％(

7、n=lO)和2．】％(“=lO)；峰面積的日內(nèi)及日間RSD分別為4．5％和5．7％。AMP、ADP及ATP的峰面積與濃度在O．125mg／mL～2．0mg／mL范國(guó)內(nèi)有良好的線(xiàn)性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0．991～O舯7，最低檢測(cè)限為0．125m94mL(S／N>_3)-將本方法用于生物組織樣品中ATP、ADP及AMP含量測(cè)定的研究尚有待進(jìn)一步深入。參考文獻(xiàn)：[1]高鴻，余志豪，喻田。等．遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)[J]，1997，20：36．[2]陳義，毛細(xì)管電泳技術(shù)及應(yīng)用[加．北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2000：16Researchont

8、heSeparationofATP,ADPandAMPbyCapillaryElectrophoresisZHOUChun-xi，YURong，LVHai-yan，LIAOJie(MedicalExperimental&AnalysisCen磚PLdGeneralHospital,Beijin91008531Abstract：Th