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《成人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)及定向誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在應(yīng)用文檔-天天文庫。
1、成人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)及定向誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞：滕勇，胡蘊(yùn)玉，安書杰，戴先文，趙黎，白建萍，李旭升，呂榮【關(guān)鍵詞】干細(xì)胞【Abstract】AIM:Tobuildamethodtoculturebonemarroesenchymalstemcells(MSCs)invitroandtoinvestigatethefeasibilityofinducingMSCsintoosteoblasts.METHODS:HumanMSCsadultbonemarroentformedafter7-10dandtheMSCsofthepa
2、ssage3odifiedcalciumcobaltstainingmethod,typeⅠcollagenandosteocalcinassaymunohistochemistryandcalciumnodeassayogeneousMSCsnodesadultbonemarroarrocells;adult;tissueengineering;osteogenesis/drugeffects 【摘要】目的：建立成人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)體外培養(yǎng)的方法，并探討定向誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞的途徑.方法：抽取成人骨髓，Percol
3、l密度梯度離心法進(jìn)行體外培養(yǎng)，貼壁細(xì)胞傳代，取第3代細(xì)胞在培養(yǎng)基中添加成骨誘導(dǎo)劑地塞米松、β甘油磷酸、維生素C，培養(yǎng)15d后，在倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，鈣－鈷法染色檢測堿性磷酸酶（ALP）表達(dá)，免疫組化（SABC法）檢測Ⅰ型膠原、骨鈣素表達(dá)，茜素紅染色檢測鈣結(jié)節(jié)形成.結(jié)果：Percoll密度梯度離心法培養(yǎng)可獲得均一的MSCs；誘導(dǎo)分化的MSCs呈典型的成骨細(xì)胞形態(tài)；ALP染色陽性率可達(dá)81%以上；Ⅰ型膠原、骨鈣素表達(dá)陽性；茜素紅染色見鈣結(jié)節(jié)形成.結(jié)論：可以從成人骨髓中培養(yǎng)出MSCs，并可定向誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞，可用作臨床骨組織工
4、程種子細(xì)胞. 【關(guān)鍵詞】骨髓，干細(xì)胞；成年人；組織工程；骨生成/藥物作用 0引言 種子細(xì)胞、支架材料、生長因子是組織工程的三大要素，尋找合適的種子細(xì)胞是成功的重要因素［1］.目前骨組織工程種子細(xì)胞主要有骨、骨膜、骨髓和其他非骨組織.骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（marroesenchymalstemcells,MSCs）因其充足，取材方便安全，便于培養(yǎng)和基因修飾，增生活躍、多向分化及成骨能力確切［2-4］，從而受到廣泛關(guān)注，具有廣泛的應(yīng)用前景.自從Maniatopoulos等［5］1988年首次報道鼠MSCs經(jīng)體外培養(yǎng)可形成鈣化的骨樣組
5、織以來，從動物骨髓誘導(dǎo)分化成骨細(xì)胞已不困難，人們目前已能從胎兒骨髓中分離出MSCs.成人骨髓中MSCs含量較少，能否分離、分離的方法如何是目前研究的方向.本研究在動物實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上建立臨床成人MSCs的培養(yǎng)和誘導(dǎo)成骨的方法，為組織工程走向臨床作準(zhǔn)備. 1材料和方法 1.1材料 骨髓取自5例骨科取髂骨患者，年齡分別為28,30,35，55,60歲.2例診斷脊柱滑脫；3例診斷四肢骨不連接.5例均無代謝性骨病及結(jié)核，肝腎功能正常.經(jīng)知情同意，術(shù)中取髂骨前從髂后上棘抽取骨髓5mL，吸入加有0.5mL肝素的20mL無菌注射器.主要試劑:
6、LDMEM低糖培養(yǎng)基、胰酶均為Gibco產(chǎn)品，胎牛血清為Hyclone產(chǎn)品，地塞米松、β甘油磷酸、維生素C均為Sigma產(chǎn)品，Percoll分離液Pharmacia產(chǎn)品.兔抗人Ⅰ型膠原多克隆抗體及免疫組化（SABC法）檢測試劑盒為中山生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，鼠抗人骨鈣素mAb為體美國BD公司產(chǎn)品，50mL一次性塑料培養(yǎng)瓶為美國Coster公司產(chǎn)品，噻唑藍(lán)（MTT）為華美生物工程公司產(chǎn)品.完全培養(yǎng)基組成：LDMEM加入10mL/L胎牛血清，青、鏈霉素終濃度1667μkat/L.成骨誘導(dǎo)條件培養(yǎng)基：完全培養(yǎng)基加地塞米松、β甘油磷酸、維
7、生素C，終濃度分別為1×10-8mol/L,50mg/L,10mmol/L. 1.2方法 1.2.1成人MSCs原代培養(yǎng)MSCs的分離將抽取的骨髓加入裝有5mL磷酸鹽緩沖液（PBS）的離心管，吸管吹打混勻，800r/min離心10min，棄去上層7mL脂滴及上清，剩余上清與細(xì)胞混勻，沿管壁緩慢滴加底部裝有Percoll（體積質(zhì)量1.073kg/L）分離液的離心管中，900g離心30min，吸取界面云霧狀白膜層，加入PBS，800r/min離心10min洗滌2遍，計數(shù).2例55歲以上患者骨髓以4×107接種于50mL培養(yǎng)瓶，另
8、外3例以2×107接種于50mL培養(yǎng)瓶.5d后半量換液，第7~10日見有較多貼壁細(xì)胞后全量換液，此后2~3d換液1次，細(xì)胞90%匯合時2.5g/L胰酶消化1∶3傳代. 1.2.2成人MSCs向成骨細(xì)胞表型誘導(dǎo)取生長良好的第2代細(xì)胞，更換培養(yǎng)液為成骨條件培養(yǎng)液，
