磨損顆粒誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶2和基質(zhì)金屬蛋白酶9生成實(shí)驗(yàn)研究

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1、磨損顆粒誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶2和基質(zhì)金屬蛋白酶9生成實(shí)驗(yàn)研究:戴閩,漆啟華,程濤,范紅先,熊建衛(wèi) 詹平,陳晟【摘要】[目的]研究和比較氧化鋁陶瓷和高分子聚乙烯磨損顆粒在air-pouch動(dòng)物模型體內(nèi)誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)和基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)產(chǎn)生及表達(dá)變化,探討在不同磨損顆粒作用下明膠酶表達(dá)規(guī)律及其在人工假體無(wú)菌性松動(dòng)病理過(guò)程中的意義。[方法]構(gòu)建小鼠air-pouch動(dòng)物模型。實(shí)驗(yàn)組分別注射氧化鋁陶瓷顆粒懸液3ml(A組)和高分子聚乙烯顆粒懸液3ml(B組),對(duì)照組注射磷酸鹽緩沖鹽水3ml。分別于注射后第3、7、14d后各處死動(dòng)物8只

2、取出air-pouch囊壁組織,光鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)反映炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和增殖程度,半定量RT-PCR及免疫組織化學(xué)染色法觀察MMP-2、MMP-9基因及蛋白表達(dá)量的變化。[結(jié)果]實(shí)驗(yàn)組炎性細(xì)胞計(jì)數(shù)、MMP-2、MMP-9基因表達(dá)量和MMP-2、MMP-9陽(yáng)性細(xì)胞率差異均有顯著性(P<0.05);且各時(shí)間點(diǎn)B組均高于A組(P<0.05);第14d時(shí),B組明顯高于A組(P<0.01)。[結(jié)論]兩種磨損顆粒均能誘導(dǎo)MMP-2、MMP-9mRNA及蛋白的表達(dá),并且高分子聚乙烯顆粒組高于氧化鋁陶瓷磨損顆粒組?!娟P(guān)鍵詞】磨損顆粒;無(wú)菌性松動(dòng);骨溶解;基質(zhì)金屬

3、蛋白酶2;基質(zhì)金屬蛋白酶9  Abstract:[Objective]Toparetheexpressionofmatrixmetalloproteinase2(MMP-2)andmatrixmetalloproteinase9(MMP-9)inducedbyaluminaandultra-high-molecular-echanismoftheperiprostheticosteolysisinducedbyinmiceurineairpouchmodelofinflammation.Theairpoucheslofsuspensioncontainin

4、g1×108/mlaluminaparticlesingroupA,lofsterilePBS.Allanimalsicroscope.RT-PCRandimmunohistochemistrymethodRNAandimmunoreactivityexpressionberandgeneandproteinexpressionofMMP-2andMMP-9ingroupAandBepoints(P<0.05).ExpressionofMMP-2andMMP-9ingroupBinaceramicandUHMMP-2andMMP-9,長(zhǎng)徑平均粒徑1.

5、17μm,;高分子聚乙烯顆粒外形近似球形,平均粒徑9.26μm。顆粒用環(huán)氧乙烷消毒,將消毒后的顆粒分別以100mlPBS配成108個(gè)/ml濃度的顆粒懸液。經(jīng)顯色基質(zhì)鱟試劑盒(衛(wèi)藥準(zhǔn)字SJ202號(hào)050904)檢測(cè)顆粒懸液樣本內(nèi)毒素含量<0.02EU/ml?! ?.2材料TRIzol為美國(guó)Invitrogen公司產(chǎn)品,RT-PCR試劑盒為美國(guó)Promega公司產(chǎn)品,MMP-2、MMP-9、B-actin引物由中國(guó)上海生工合成,兔抗MMP-2多克隆抗體、兔抗MMP-9多克隆抗體均為美國(guó)SantaCruze公司產(chǎn)品,辣根過(guò)氧化酶/FITC/標(biāo)記羊抗兔IgG

6、為北京中杉橋公司產(chǎn)品。其它試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純?! ?.3動(dòng)物的分組及模型的構(gòu)建取健康昆明系小鼠72雌雄不限,體重20~25g(南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供,清結(jié)級(jí))。A組:24只,注射氧化鋁陶瓷磨損顆粒懸液;B組:24只,注射高分子聚乙烯顆粒懸液;對(duì)照組:24只,注射PBS。參照Yang等[4]方法構(gòu)建air-pouch動(dòng)物模型,air-pouch動(dòng)物模型構(gòu)建成功。按分組分別將3ml顆粒懸液(超聲分散后)或PBS注入air-pouch動(dòng)物模型體內(nèi),分別于注射后3、7及14d,每組脫頸椎各處死8只,采集囊壁組織,留備檢測(cè)用?! ?.4觀察和檢測(cè)指標(biāo)

7、  1.4.1RT-PCR檢測(cè)MMP-2、MMP-9基因的表達(dá)按Trizol法提取細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,各引物序列見(jiàn)表1,所有反應(yīng)體系按以下條件進(jìn)行反應(yīng):預(yù)變性94℃5min,變性94℃30min,退火60℃30s,延伸72℃30s,進(jìn)行35個(gè)循環(huán),最后72℃延伸10min。用全自動(dòng)凝膠分析系統(tǒng)灰度掃描分析,結(jié)果以目的基因與β-actin基因擴(kuò)增片段的灰度之比表示?! ?.4.2免疫組織化學(xué)檢測(cè)MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)將囊壁組織常規(guī)石蠟包埋、切片、常規(guī)行HE染色,光學(xué)顯微鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)反映炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和增殖程度。免疫組化石蠟切片,常規(guī)脫蠟及

8、脫水,3%H2O2及10%正常山羊血清封閉后,熱抗原修復(fù),加入一抗

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