木犀草素體內(nèi)抗炎作用機(jī)制研究

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1、木犀草素體內(nèi)抗炎作用機(jī)制研究：張毅，王旭光，楊展，何惠娟【摘要】目的探討木犀草素(Lut)的體內(nèi)抗炎療效及作用機(jī)制。方法采用角叉菜膠致大鼠足爪腫脹模型，觀察Lut對(duì)足爪腫脹度的影響；酶免疫測(cè)定法(EIA)測(cè)定炎足足跖部的滲出液前列腺素E2（PGE2）的含量；免疫組織化學(xué)法(IHC)及免疫印跡(ethodsThemodelofcarrageenaninducededemaofrathindpaamodelethasone(forapositivecontrol).ThePGE2contentintheedemaexudateeasuredbyEIA.The

2、COX2expressionoftheedemapamunohistochemistryandapamatoryeffectonratinflammationinducedbycarrageenanprobablythroughthemechanismsoftheinhibitionofCOX2proteinexpressionandofPGE2production.　　Keymation；prostaglandinE2　　木犀草素(Luteolin，Lut)屬于黃酮類化合物，主要存在于菊花、忍冬花、紫蘇葉等天然藥物，近年研究表明Lut具有抗氧化、抗腫

3、瘤、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等作用［12］。我們研究發(fā)現(xiàn)Lut在體外能抑制環(huán)氧合酶2(COX2)mRNA及蛋白表達(dá)，同時(shí)降低NFκB的DNA結(jié)合活性和蛋白表達(dá)［3］，其抗炎機(jī)制可能與此有關(guān)。為進(jìn)一步探討Lut的抗炎作用機(jī)制，我們建立大鼠足爪腫脹炎癥模型，研究Lut對(duì)炎癥大鼠COX2表達(dá)及前列腺素E2（PGE2）生成的影響。1材料和方法1.1材料清潔級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量150～250g，由廣東醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。角叉菜膠、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺等為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；Lut（純度>98%）和PGE2EIAKit為美國(guó)Cayman公司產(chǎn)品；β

4、actin山羊IgG多克隆抗體、COX2山羊IgG多克隆抗體、免疫組化SP試劑盒均為北京中山公司產(chǎn)品；PVDF膜為美國(guó)PallGelman公司產(chǎn)品。1.2方法　　1.2.1大鼠分組　　50只大鼠隨機(jī)分為5組，分別為空白對(duì)照組、2mg/kg地塞米松(Dex)陽性對(duì)照組及40、80、120mg/kgLut3個(gè)劑量組，每組10只。實(shí)驗(yàn)時(shí)分別腹腔注射等體積生理鹽水、地塞米松及40、80、160mg/kg劑量的Lut?！　?.2.2大鼠足爪腫脹測(cè)定　　腹腔注射給藥30min后于大鼠右后足跖皮下注射1%角叉菜膠0.1mL/只致炎，分別在致炎前，致炎后0.5、1、

5、2、3、4、5h用大鼠足爪容積測(cè)定儀測(cè)量炎足爪容積，計(jì)算各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)足爪腫脹度。腫脹度(mL)=致炎后右后足容積－致炎前右后足容積。　　1.2.3大鼠足爪炎性滲出物中PGE2含量的測(cè)定　　大鼠右后足致炎5h后處死大鼠，于大鼠右踝關(guān)節(jié)處剪下足爪，稱重剝皮浸泡于5mL生理鹽水中浸泡30min，取出足爪，離心浸泡液15min(3000×g)，取上清液0.5mL，以PGE2EIAKit測(cè)定其中的PGE2含量(μg/g)，并計(jì)算抑制率?！　∫种坡蔍R(%)=對(duì)照組PGE2含量-給藥組PGE2含量對(duì)照組PGE2含量×100%　　1.2.3g加入0.2mL細(xì)胞裂解

6、液在勻漿器中勻漿后，將裂解液于冰上超聲破碎細(xì)胞（10s/次×3次，間隔15s），4℃，12000g離心10min,收集上清液，考馬斯亮藍(lán)（G250）染色法測(cè)上清液蛋白質(zhì)含量。每組各取50μg蛋白質(zhì)樣品加上樣緩沖液煮沸變性后，進(jìn)行10%SDSPAGE；電轉(zhuǎn)移至PVDF膜；用含5%脫脂奶粉的TBS(PH8.0)封閉2h；分別加入適量COX2和βactin多克隆抗體，搖床上室溫反應(yīng)2h；洗膜3次每次20min；加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫反應(yīng)2h；洗膜后作ECL化學(xué)發(fā)光，X片曝光顯影。圖像經(jīng)掃描儀掃描后，用圖像分析軟件BandScan5.0進(jìn)行光密度積分

7、值分析，計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參照βactin蛋白表達(dá)量的光密度積分值之比作為目的蛋白表達(dá)量的相對(duì)含量值?！　?.2.4免疫組織化學(xué)（IHC）　　取足跖部位的組織，用10%中性緩沖福爾馬林及時(shí)固定，石蠟包埋，切片，貼片，常規(guī)脫蠟。0.1mol/LPBS(pH7.4)浸泡5min。微波修復(fù)抗原。滴加正常山羊血清封閉液(試劑B)，室溫20min。滴加1:50稀釋的COX2羊IgG單克隆抗體，陰性對(duì)照以PBS代替一抗，于4℃孵育過夜。PBS洗3次。滴加鏈霉菌抗生物素過氧化物酶溶液(試劑C)，室溫孵育10min，PBS沖洗3次。滴加試劑SABC(試劑D)，37℃，

8、30min，PBS沖洗3次。DAB顯色。蘇木素輕度復(fù)染。脫水，透明