資源描述：
《人眼小梁組織及體外培養(yǎng)的人眼小梁細胞sparc mrna及其蛋白表達》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在應用文檔-天天文庫。
1、人眼小梁組織及體外培養(yǎng)的人眼小梁細胞SPARCmRNA及其蛋白表達【關(guān)鍵詞】人眼 ExpressionofSPARCmRNAandSPARCproteininhumantrabecularmeshantrabecularmeshRNAareexpressedinhumantrabecularmeshantrabecularmesharyopenangleglaua(POAG).METHODS:RTPCRandCsedbyantiSPARCantibody.RESULTS:RTPCRofTMandTMCsusingSPARCspecificprimersoftheRNAdispla
2、yedthepresenceofthepredictedbandofapproximately300bp.andTMCscanexpressSPARCmRNAanditscorrelativeprotein,ulationanddegradationofextracellularmatrix. 【Keyesheshatrix；primaryopenangleglaua 【摘要】目的：研究人眼小梁組織（TM）及體外培養(yǎng)的人眼小梁細胞（TMCs）是否可以表達酸性富含胱氨酸分泌型蛋白（SPARC)mRNA及SPARC蛋白.探討SPARC蛋白在原發(fā)性開角型青光眼（POAG）發(fā)病機制中的
3、作用.方法：分別采用RTPCR和r為43×103處出現(xiàn)蛋白條帶.TMCs抗SPARC免疫熒光染色表現(xiàn)為胞質(zhì)均勻著色.結(jié)論：TM組織及體外培養(yǎng)的人眼TMCs均可表達SPARCmRNA及其相關(guān)蛋白，并起著調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)（ECM）的生成和降解作用. 【關(guān)鍵詞】小梁組織；小梁細胞；酸性富含胱氨酸分泌型蛋白；細胞外基質(zhì)；原發(fā)性開角型青光眼 0引言 小梁網(wǎng)（trabecularmesheshatrix,ECM）組成的無定型組織層.ECM在細胞外的表達處于持續(xù)的重塑狀態(tài).其合成和降解是調(diào)節(jié)房水流出阻力的一個重要環(huán)節(jié)［1］.研究表明酸性富含胱氨酸分泌型蛋白（secretedproteinac
4、idicrichincysteine，SPARC）在調(diào)節(jié)ECM的合成和降解中起著重要的作用.它是一種細胞外基質(zhì)相關(guān)糖蛋白的調(diào)節(jié)蛋白，又稱為骨連蛋白，由3個結(jié)構(gòu)域組成，Mr為43×103.在多種組織中都發(fā)現(xiàn)了SPARC基因和其相關(guān)蛋白的表達，并起著調(diào)節(jié)細胞黏附、增殖、ECM的合成/轉(zhuǎn)化以及ECM與細胞連接的作用［2］.我們研究人眼TM組織和體外培養(yǎng)的人眼TMCs是否表達SPARCmRNA及其相應的SPARC蛋白，以進一步探討改善房水流出、調(diào)節(jié)眼壓（intraocularpressure,IOP）的機制以及原發(fā)性開角型青光眼（primaryopenangleglaua,POAG）的發(fā)病
5、機制. 1材料和方法 1.1材料 DMEM培養(yǎng)基、Trizol總RNA提取試劑盒、RTPCR試劑盒、Taq酶均購自Gibico公司;BCA蛋白定量試劑盒（Pierce公司）；羊抗人SPARCpAb（SantaGruz公司）；熒光素標記的兔抗山羊IgG（華美技術(shù)有限公司）.人眼TM組織來自角膜移植供眼，皆為死后12h以內(nèi)剝離的TM組織，分別用于細胞培養(yǎng)及組織SPARCmRNA提取、RTPCR及SPARC蛋白Cs體外培養(yǎng)行人眼TMCs體外培養(yǎng)組織學鑒定［3］，取傳3代生長良好細胞用于實驗. 1.2.2組織和細胞總mRNA提取取0.1gTM組織，加1mLTRIzol，勻漿，加氯仿
6、、異丙醇沉淀RNA，離心，加DEPC水配制的乙醇，-20℃保存，選用A260nm/A280nm值近似2.0者用于RT反應.細胞mRNA提?。罕鲜占瘋?代TMCs（每份樣品約3×106個細胞），加入1mLTRIzol，注射器內(nèi)反復抽提，其余同組織mRNA提取. 1.2.3組織和細胞SPARCmRNARTPCR分析 1.2.3.1引物設計參考文獻［4］的方法，擴增長度300bp，內(nèi)參照采用βactin，擴增長度451bp. 1.2.3.2逆轉(zhuǎn)錄反應cDNA合成采用20μL反應體系，42℃溫育15min,99℃加熱5min,5℃5min終止反應. 1.2.3.3RCR擴增采用2
7、0μL反應體系.PCR方案：94℃預變性5min，94℃變性60s,50℃退火60s,72℃延伸60s,共35個循環(huán). 1.2.3.4產(chǎn)物鑒定取5μLPCR反應產(chǎn)物,15g/kg瓊脂糖凝膠電泳,溴化乙錠染色,紫外燈下觀察有無特異性條帶. 1.2.5免疫熒光細胞染色取生長于蓋玻片的傳3代人眼TMCs，固定，分別加一抗（山羊抗人antiSPARCIgG）及熒光素標記二抗（兔抗羊mAb）行免疫熒光染色，激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞內(nèi)SPARC表達.采用PBS代替一抗孵育細
