人erβ af1融合蛋白的表達及其多克隆抗體制備

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1、人ERβAF1融合蛋白的表達及其多克隆抗體制備：袁斌,仇瑋祎△,李杰之,丁麗華,韓聚強,熊志紅,楊智洪,葉棋濃【摘要】　　目的:制備雌激素受體β多克隆抗體。方法:從人乳腺cDNA文庫中PCR擴增ERβAF1結(jié)構(gòu)域（1～144位氨基酸）,DNA重組插入原核表達質(zhì)粒pGEXKG,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,異丙基βD硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達GSTERβAF1融合蛋白。純化后免疫BALB/c小鼠,制備鼠多抗血清。通過r)約為60000,其一級結(jié)構(gòu)由N端到C端,可分為A/B區(qū)(轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū))、C區(qū)(DNA結(jié)合區(qū))、D區(qū)(多變鉸鏈區(qū))、E/F區(qū)(

2、配體結(jié)合區(qū))等6個功能區(qū)[4]。ERβ與ERα相比肽鏈較短,但其氨基酸序列在DNA結(jié)合區(qū)和配體結(jié)合區(qū)與ERα有高度同源性,分別達96%和60%,在活性功能區(qū)AF1和AF2同源性很低[5]。在分子水平上,ERβ通過經(jīng)典的ERE途徑、AP1和Sp1位點等[6],與內(nèi)源性配體（如雌激素）或其他配體（如抗雌激素和植物雌激素）發(fā)生反應(yīng),進而調(diào)節(jié)一系列靶基因,調(diào)控靶組織（器官）某些正常生理功能的發(fā)揮（如維持骨密度,生殖器官的發(fā)育）和某些腫瘤（如乳腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌）的發(fā)生、發(fā)展過程。由于多種腫瘤中都有ERβ的表達,且共表達水平降低,因此ERβ極有可能成

3、為一種新型腫瘤分子標記,有助于臨床腫瘤的早期診斷。由于ERβ在正常生理及病理過程中均起到重要作用,因此對ERβ功能的深入研究具有十分重要的意義?！　?材料和方法　　1.1材料克隆載體pGEXKG、pcDNA3FLAGERβ重組質(zhì)粒、E.coliDH5α均為本實驗室保存。抗FLAG的單克隆抗體(mAb)均購自Sigma公司;辣根過氧化物酶（HRP）偶聯(lián)的羊抗鼠IgG購自Vector公司;SP試劑盒購自北京中山公司;限制性內(nèi)切酶BamHI和XhoI購自NEB公司;高保真pfuDNA聚合酶、T4DNA連接酶及IPTG購自Promega公司;質(zhì)粒提

4、取試劑盒(包括小量提取、大量制備2種)購自Qiagen公司;DNA膠回收試劑盒及PCR產(chǎn)物回收試劑盒購自Promega公司?！　?.2方法　　1.2.1重組質(zhì)粒的構(gòu)建以乳腺cDNA文庫(Clontech)為模板,以P1(5′CGGGATCCATGGATATAAAAAACTCACCA3′)和P2(5′CCGCTCGAGCTACCTCTTTGAACCTGGACC3′)為引物,PCR擴增編碼1～144位氨基酸的ER片段。以BamHI和XhoI雙酶切PCR產(chǎn)物,將PCR產(chǎn)物插入到同樣雙酶切的pGEXKG載體中,即得重組質(zhì)粒pGSTERβ(1～

5、144位氨基酸,aa)。上述克隆所用PCR擴增條件為:94℃變性3min后,按以下參數(shù)進行30次循環(huán):94℃變性30s,58℃復(fù)性30s,72℃延伸1min。最后72℃延伸7min。PCR擴增所用酶為pfuDNA聚合酶。重組質(zhì)粒經(jīng)載體上的通用引物測序?！　?.2.2GST融合蛋白的誘導(dǎo)表達及純化將上述構(gòu)建的表達GST的融合蛋白的重組質(zhì)粒和表達GST的空載體pGEXKG轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α中。轉(zhuǎn)化于37℃振蕩過夜,再按2%的接種量轉(zhuǎn)接,30℃培養(yǎng)6h后,加入IPTG至終濃度為0.1mmol/L,20℃繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)過夜。收集上述誘導(dǎo)菌,用谷胱

6、甘肽Sepharose4B小顆粒純化GST融合蛋白,基本按Pharmacia公司提供的方法進行,即按10∶1(V/V)的比例加入細胞裂解液(50mmol/LTrisHClpH7.5、150mmol/LNaCl、1mmol/LEDTA、0.3mmol/LDTT、1g/LNP40及蛋白酶抑制劑),超聲破碎,離心收集上清液,加入適量谷胱甘肽Sepharose4B小顆粒,結(jié)合3h。再收集谷胱甘肽Sepharose4B小顆粒,用細胞裂解液充分洗去未結(jié)合蛋白質(zhì)后,即得到結(jié)合有GSTERβ(1～144位氨基酸)融合蛋白或GST蛋白的谷胱甘肽Sep

7、harose4B小顆粒。　　1.2.3多克隆抗體的制備將純化的GSTERβ(1～144aa)融合蛋白與福氏完全佐劑1∶1混勻后,皮下多點注射BALB/c小鼠,初次免疫后每3周使用不完全弗氏佐劑加強免疫1次,末次免疫后第10天眼球取血,免疫血清于-70℃保存[7]?！　?.2.4哺乳動物細胞的轉(zhuǎn)染用無雙抗的DMEM培養(yǎng)基(含100mL/LFBS)將293T細胞接種在12孔板中。接種后24h,將總量為2.0μgDNA與80μLDMEM培養(yǎng)基混合,再將2.5μLLipofectamine2000與80μLDMEM培養(yǎng)基混合,然后將上述2種溶液混合,室

8、溫放置15min,加入到細胞中。　　1.2.5CF7、MDMBA435、ZR751、MDMBA231、MDMBA453和T