人突變型低氧誘導因子1α對大鼠后肢缺血模型血管新生的影響

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1、人突變型低氧誘導因子1α對大鼠后肢缺血模型血管新生的影響【摘要】目的：探討564與402雙位點突變的HIF1α基因(AdHIF1α564Ala402Ala,簡稱AdH564/402）在大鼠下肢急性缺血模型中的表達及對血管新生的影響.方法：①將先期構建的AdH564/402在HEK293A細胞中進行擴增，用氯化銫濃度梯度離心法進行腺病毒純化.用電子顯微鏡、PCR及測序的方法鑒定并用分光光度計法測定病毒滴度；②構建急性大鼠下肢缺血模型，隨機分為4組，分別以AdLacZ,AdH0,AdH564/402和

2、生理鹽水（NS）轉染術側下肢骨骼肌，于轉染后1,3,5,7d，應用RTPCR測定骨骼肌中HIF1αmRNA的表達量；③基因轉染后28d，選擇性下肢動脈造影及血管鑄型觀察血管密度.結果：①經擴增、純化后基因突變區(qū)信息保存完好，最終滴度達到（6.29±0.26）×1014OPU（opticalparticleunit,光學顆粒單位）/L.②突變體基因AdH564/402的相對表達量高于野生型HIF1α基因（P=0.000）；且以第7日最高（P=0.000）；經兩兩比較，不同基因組間及不同轉染天數(shù)間的表達量均有顯著

3、的統(tǒng)計學差異（P=0.000）.③基因轉染28d后造影及血管鑄型結果顯示：AdH564/402組的絨毛小血管數(shù)大于AdH0組及其他各組.結論：①外源性突變體AdH564/402基因可促進體內HIF1αmRNA的表達.②外源性突變體AdH564/402基因可促進缺血骨骼肌的側支血管形成及微血管新生.③突變體AdH564/402基因的生物學功能較野生型基因AdH0更強.【關鍵詞】低氧誘導因子1血管生成逆轉錄聚合酶鏈反應動脈造影　　0引言　　人低氧誘導因子1(hypoxiainduciblefactor1,

4、HIF1)是應答細胞氧張力變化的基因表達的重要調節(jié)因子［1］，由兩個亞單位組成，即氧調節(jié)亞單位HIF1α和構成性表達的亞單位HIF1β［2］.HIF1α可調控下游60多種與血管生長、血管張力、糖代謝、紅細胞生成及干細胞誘導分化等相關的基因，包括血管內皮生長因子(VEGF)及其受體（Flt1），神經纖毛蛋白1（Neuropilin1）,血管生成素(Ang)1,2,4,血小板衍生生長因子（PDGF）和胎盤生長因子(PIGF)中的其他成員［3］.由于其獨特的結構，HIF1α只有在低氧條件下才能發(fā)揮功能

5、，其蛋白形式在常氧下5min即發(fā)生降解.我們先期對HIF1α的關鍵位點進行了定點突變，并將其成功包裝腺病毒［4-5］.我們將其應用于大鼠下肢急性缺血模型中，觀察其對血管新生的影響.　　1材料和方法　　1.1材料564與402雙位點突變的人低氧誘導因子1α(AdHIF1α564Ala402Ala,簡稱AdH564/402)、野生型人低氧誘導因子1α(簡稱AdH0)及β半乳糖苷酶(βgalactosidase)基因(簡稱AdLacZ)，均由本課題組構建.RNAisoReagent(TaKaRa公司),

6、TaqDNA聚合酶(TaKaRa公司)，含碘3.5×105g/L的歐乃派克TM（上海安盛藥業(yè)有限公司），PTPCR儀（FTC2000，上海），NSX6000型數(shù)字血管X射線攝影裝置（Neusoft公司生產）.HIF1α上游引物：5′TCGACACAGCCTGGATATGA3′；下游引物：5′CGGCTGCGGCCAGCAAAGTT3′.GAPDH上游引物：5′ACCACAGTCCATGCCATCAC3′；下游引物：5′TCCACCACCCTGTTGCTGTA3′.由上海生物工程公司合成.清潔級

7、雄性L，對照組注射等量的生理鹽水（NS）.縫合皮膚，繼續(xù)分籠喂養(yǎng).　　1.2.4RTPCR測定骨骼肌中HIF1αmRNA的表達于基因轉染第1,3,5,7d，過量麻醉處死大鼠，取術側下肢注射部位的骨骼肌快速液氮冰凍，取80mg在液氮下研碎，用RNAisoReagent提取組織總RNA，反轉錄合成cDNA，PCR擴增，條件為：95℃預變性5s，95℃變性30s，55℃退火45s，72℃延伸45s，共30個循環(huán).72℃5min,4℃?zhèn)溆?用GAPDH基因作為內對照，RTPCR測定HIF1αmRNA的相對表達量.　　

8、1.2.5大鼠下肢動脈血管造影基因轉染后第28日，麻醉大鼠后剖開腹腔，順行穿刺腹主動脈，用稀釋1倍的含碘3.5×105g/L歐乃派克行動脈造影，手推造影劑2～4mL/次，以6幅/s的速度連續(xù)攝像記錄.以假手術組為陰性對照.　　1.2.6大鼠下肢動脈血管鑄型基因轉染后第28日，過量麻醉處死大鼠，切開腹腔，暴露腹主動脈，順行插管固定，分次灌注50g