他克莫斯對(duì)樹突狀細(xì)胞分化、成熟和功能的影響

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1、他克莫斯對(duì)樹突狀細(xì)胞分化、成熟和功能的影響【摘要】目的：探討他克莫斯（tacrolimus,FK506）對(duì)大鼠骨髓源性樹突狀細(xì)胞(DCs)分化、成熟和免疫學(xué)活性的影響.方法：收集大鼠骨髓源性DCs，加入不同濃度的FK506進(jìn)行培養(yǎng)，采用流式細(xì)胞術(shù)行DCs表型分析，ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清中IL12的水平并行體外混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)（MLR），觀察DCs對(duì)同種T細(xì)胞的刺激能力.構(gòu)建大鼠腎移植模型，于移植前7d輸注FK506處理的DCs，觀察移植腎存活時(shí)間.采用ELISA法檢測(cè)MLR培養(yǎng)上清和移植大鼠血清中TH1/TH2細(xì)胞因子IFNγ，IL2，IL4和IL10

2、的表達(dá)水平.結(jié)果：FK506對(duì)DCs表面分子(Iad，CD80和CD86)的表達(dá)無明顯影響(P>0.05)，而IL12的分泌水平降低(P<0.05)，并顯著抑制DCs對(duì)T細(xì)胞的激活能力(P<0.05).大鼠移植腎存活時(shí)間分別為對(duì)照組(6.3±0.7)d，DCs組(7.2±1.4)d與FK506DCs組(19.0±2.3)d，對(duì)照組與DCs組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而FK506DCs組與DCs組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05).在體外MLR和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)K506DCs組與DCs組比較，IL2，IFNγ表達(dá)水平均顯著降低(P&l

3、t;0.05)，IL4表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，而IL10的表達(dá)水平在體外顯著升高(P<0.05)，但在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中與DCs組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05).結(jié)論：FK506不影響DCs的分化與成熟，對(duì)其免疫學(xué)功能起負(fù)性調(diào)節(jié)作用.可能機(jī)制為FK506通過抑制DCsIL12的分泌，來促使Th1/Th2亞群分化傾向于Th2方向.【關(guān)鍵詞】他克莫斯;樹突狀細(xì)胞;免疫耐受;器官移植　　【Abstract】AIM:Toinvestigatetheeffectoftacrolimus(FK506)onthedifferentiation,mat

4、urationandfunctionofratbonemarrousatconcentrationsof5-20μg/LtotheDCscultureandcheckedtheexpressionsofactivationmarkers(Iad,CD80andCD86)byfloetry,thereleaseofcytokinesIL12byELISAandthestimulatorycapacityoftheresultedDCsbymixedlymphocytereaction(MLR).ThirtyCSF)與外源性脂多糖(LPS)（Sigma公司）；RP

5、MI1640培養(yǎng)基及胎牛血清（Gibco公司）；PE標(biāo)記的小鼠抗大鼠Iad，CD80，CD86mAb（eBioscience公司）；IL12，IL4，IL10，IL2，IFNγ的ELISA試劑盒（Bender公司）；3HTdR（AmershamLifeScience公司）.EpicXL型流式細(xì)胞儀(美國BeckmanCoulter公司).　　1.2方法　　1.2.1骨髓DCs的提取與鑒定參照文獻(xiàn)［2］的方法，取SD大鼠（供者）股骨，沖洗出骨髓細(xì)胞，以1∶10的體積比加入37℃預(yù)溫的TrisNH4Cl去除紅細(xì)胞；加GNK緩沖液終止反應(yīng)，離心洗滌2次

6、；用RPMI1640調(diào)細(xì)胞密度為1×109/L，37℃,50mL/LCO2條件下培養(yǎng)2h；輕輕洗去非粘附細(xì)胞；在貼壁細(xì)胞中加入含10μg/LrrIL4和10μg/LrrGMCSF的RPMI1640完全培養(yǎng)基，37℃,50mL/LCO2條件下培養(yǎng)6～7d，收集生長狀態(tài)良好的DCs備用.　　1.2.2DCs表型與分泌IL12水平分析將DCs分成4組，每組設(shè)3復(fù)孔：①對(duì)照組(DCs組)；②FK506處理組(FK506DCs組)：培養(yǎng)液中加入不同濃度FK506（5,10,20μg/L）；③脂多糖刺激組(LPSDCs組)：在培養(yǎng)結(jié)束前18h加入100μg/LLPS

7、；④FK506處理+脂多糖刺激組(FK506LPSDCs組).在37℃,50mL/LCO2條件下培養(yǎng)7d，收集培養(yǎng)上清液，ELISA方法檢測(cè)IL12水平（按試劑盒說明書進(jìn)行）.收獲細(xì)胞（2×109/L）；分別加入PE標(biāo)記的抗Iad,抗CD80或抗CD86mAb(終濃度5mg/L)，4℃作用45min；流式細(xì)胞儀分析，以中位熒光強(qiáng)度（MFI）作為檢測(cè)指標(biāo).　　1.2.3體外混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)分析取I1640培養(yǎng)基培養(yǎng)72h；于培養(yǎng)結(jié)束前18h每孔加入3HTdR3.7×104Bq；β計(jì)數(shù)儀測(cè)量待測(cè)細(xì)胞的3HTdR摻入值(cpm).　　1.2.4大鼠

8、腎移植模型