神經(jīng)甾體化合物對pc12細胞損傷的保護作用

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1、神經(jīng)甾體化合物對PC12細胞損傷的保護作用【關(guān)鍵詞】β淀粉樣蛋白；PC12細胞；神經(jīng)甾體　　阿爾茨海默病(AD)是一種可引起大腦智能進行性衰退的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。其中,神經(jīng)元外的β淀粉樣蛋白(βAP)沉積，形成老年斑的中心，并造成神經(jīng)元的受損，是AD重要的神經(jīng)病理學特征，被公認為AD發(fā)病中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，因而探討βAP的神經(jīng)毒作用機制，成為AD研究中的熱點〔1〕。而在神經(jīng)退行性病變中，神經(jīng)細胞損傷涉及多種因素，微循環(huán)障礙可導致細胞能量供應短缺，缺血后再灌注所致的一氧化氮和氧自由基損傷等，可加重細胞病變的進展。近年來研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)甾體如孕烯醇酮、孕酮等，對衰老、記憶、行為等活動

2、具有調(diào)節(jié)作用，目前在中樞神經(jīng)調(diào)節(jié)中所起的作用越來越被人們所重視〔2〕。CPU0303是一種新型的孕激素衍生物，本實驗通過建立PC12細胞損傷模型，初步探討其對神經(jīng)細胞損傷的保護作用?！　?材料與方法　　1.1材料　　神經(jīng)甾體化合物(CPU0303)為孕激素衍生物，由中國藥科大學向華副教授提供，溶于DMSO配制成0.1mol/L的母液，用時加PBS稀釋至所需濃度。PC12細胞株購自上海細胞所。小牛血清（杭州四季青工程材料研究所）；胰蛋白酶（華美生物工程公司）；DMEM培養(yǎng)基、Aβ25～35和MTT)購自Sigma公司；乳酸脫氫酶(LDH)測定試劑盒、丙二醛(MDA)測定試劑盒均

3、為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品；其余試劑均為市售分析純?！　?.2方法　　1.2.1PC12細胞培養(yǎng)及其損傷模型的建立PC12細胞復蘇后接種于培養(yǎng)瓶中，加入含10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置于37℃，5％CO2，飽和濕度條件下培養(yǎng)，2～3d換液1次。取對數(shù)生長期細胞用于實驗?！　?.2.2實驗分組　　空白對照組，常規(guī)加入培養(yǎng)液；Aβ25～35損傷模型組，加入終濃度為20μmol/L的Aβ25～35培養(yǎng)24h；H2O2氧化應激損傷模型組，加入終濃度為100μmol/LH2O2作用24h；給藥組，用終濃度為0.01，0.1，1μmol/L的CPU0303預處理30min，然后加入各

4、損傷劑共同作用24h。每組6孔。　　1.2.3MTT法檢測細胞存活率　　細胞分組處理后，每孔加入0.5mg/mlMTT20μl，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4h后，吸棄孔內(nèi)上清液，加入DMSO，150μl/孔，振搖10min，使結(jié)晶充分溶解。用酶標儀在波長為570nm處測定每孔的吸光值，按公式計算抑制率：抑制率%=〔（OD給藥組-OD模型組）/（OD空白對照組-OD模型組）〕×100%?！　?.2.4LDH活力測定　　PC12細胞損傷作用發(fā)生24h后，收集培養(yǎng)液200μl，按LDH試劑盒測定說明，用全自動生化分析儀測定上清中所含LDH濃度。按公式計算抑制率：抑制率%=(LDH模型組-LD

5、H給藥組)/(LDH模型組-LDH對照組)×100%?！　?.2.5脂質(zhì)過氧化物MDA測定　　PC12細胞損傷后，去除原培養(yǎng)液，用PBS洗2次，加入0.1mol/LPBS-0.05mmol/LEDTA(pH8.0)及1%TritonX100溶解細胞，加入25%H3PO4沉淀蛋白，于4℃6000r/min離心50min，取上清液，按試劑盒說明，采用硫代巴比妥酸法測定MDA含量。按公式計算抑制率：抑制率/%=(MDA模型組-MDA給藥組)/(MDA模型組-MDA對照組)×100%?！　?.3統(tǒng)計學處理　　兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗，結(jié)果以x±s來表示。　　2.2CPU0303對LD

6、H釋放的影響　　與空白對照組相比，模型損傷組LDH的釋放明顯增加（P<0.01)，CPU0303能明顯降低損傷細胞LDH的釋放，并有劑量相關(guān)性。見表2。表2CPU0303對PC12損傷模型中LDH含量的影響（略)　　2.3CPU0303對MDA含量的影響　　與空白對照組比較，模型損傷組MDA生成顯著增多（P＜0.01），CPU0303能減少細胞MDA的生成，并呈劑量相關(guān)性（P＜0.01，P＜0.05）。見表3。表3CPU0303對PC12損傷模型中MDA含量的影響（略)　　3討論　本研究分別采用可溶性Aβ25～35和H2O2用于PC12細胞，造成AD早期病理損害模

7、型和氧化應激損傷模型。Aβ25～35是具有生物活性的片段，在凝聚形成Aβ纖維的過程中，對神經(jīng)細胞顯示毒性作用，對引起與AD病相關(guān)的神經(jīng)元變性起關(guān)鍵作用〔3〕。其機制可能是在形成Aβ纖維的過程中誘發(fā)反應性氧自由基(ROS)在神經(jīng)元中聚集，氧化應激和繼發(fā)鈣離子平衡的破壞〔4〕。同時在病理條件下，機體產(chǎn)生大量自由基，或機體抗氧化防御系統(tǒng)遭到破壞，造成細胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞，最終導致自由基從正常線粒體電子傳遞鏈中漏出。自由基所介導的腦損傷不僅發(fā)生在缺血期間，而且在隨后的血液再灌注過程中仍是