分離純化蛋白質(zhì)的方法及原理

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1、（二）利用溶解度差別影響蛋白質(zhì)溶解度的外部因素有：1、溶液的pH；2、離子強(qiáng)度；3、介電常數(shù)；4、溫度。但在同一的特定外部條件下，不同蛋白質(zhì)具有不同的溶解度。1、等電點(diǎn)沉淀：原理：蛋白質(zhì)處于等電點(diǎn)時(shí)，其凈電荷為零，由于相鄰蛋白質(zhì)分子之間沒有靜電斥力而趨于聚集沉淀。因此在其他條件相同時(shí)，他的溶解度達(dá)到最低點(diǎn)。在等電點(diǎn)之上或者之下時(shí)，蛋白質(zhì)分子攜帶同種符號的凈電荷而互相排斥，阻止了單個(gè)分子聚集成沉淀，因此溶解度較大。不同蛋白質(zhì)具有不同的等電點(diǎn)，利用蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)的溶解度最低的原理，可以把蛋白質(zhì)混合物分開。當(dāng)pH被調(diào)到蛋白質(zhì)混合

2、物中其中一種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，這種蛋白質(zhì)大部分和全部被沉淀下來，那些等電點(diǎn)高于或低于該pH的蛋白質(zhì)則仍留在溶液中。這樣沉淀出來的蛋白質(zhì)保持著天然的構(gòu)象，能重新溶解于適當(dāng)?shù)膒H和一定濃度的鹽溶液中。5、鹽析與鹽溶：原理：低濃度時(shí)，中性鹽可以增加蛋白質(zhì)溶解度這種現(xiàn)象稱為鹽溶.鹽溶作用主要是由于蛋白質(zhì)分子吸附某種鹽類離子后，帶電層使蛋白質(zhì)分子彼此排斥，而蛋白質(zhì)與水分子之間的相互作用卻加強(qiáng)，因而溶解度增高。球蛋白溶液在透析過程中往往沉淀析出，這就是因?yàn)橥肝龀チ他}類離子，使蛋白質(zhì)分子之間的相互吸引增加，引起蛋白質(zhì)分子的凝集并沉淀。當(dāng)

3、溶液的離子強(qiáng)度增加到一定程度時(shí)，蛋白質(zhì)溶解程度開始下降。當(dāng)離子強(qiáng)度增加到足夠高時(shí)，例如飽和或半飽和程度，很多蛋白質(zhì)可以從水中沉淀出來，這種現(xiàn)象稱為鹽析。鹽析作用主要是由于大量中性鹽的加入使水的活度降低，原來溶液中的大部分甚至全部的自由水轉(zhuǎn)變?yōu)辂}離子的水化水。此時(shí)那些被迫與蛋白質(zhì)表面的疏水集團(tuán)接觸并掩蓋他們的水分子成為下一步最自由的可利用的水分子，因此被移去以溶劑化鹽離子，留下暴露出來的疏水基團(tuán)。蛋白質(zhì)疏水表面進(jìn)一步暴露，由于疏水作用蛋白質(zhì)聚集而沉淀。鹽析沉淀的蛋白質(zhì)保持著他的天然構(gòu)象，能再溶解。鹽析的中性鹽以硫酸銨為最佳，在

4、水中的溶解度很高，而溶解度的溫度系數(shù)較低。3、有機(jī)溶劑分級分離法：與水互溶的有機(jī)溶劑（甲醇、乙醇和丙酮等）能使蛋白質(zhì)在水中的溶解度顯著降低。在室溫下有機(jī)溶劑會引起蛋白質(zhì)變性，如果預(yù)先將有機(jī)溶劑冷卻到-40°C以下，然后在不斷攪拌下逐滴加入有機(jī)溶劑，以防局部濃度過高，那么變性可以得到很大程度緩解。蛋白質(zhì)在有機(jī)溶劑中的溶解度也隨溫度、pH和離子強(qiáng)度而變化。在一定溫度、pH和離子強(qiáng)度條件下，引起蛋白質(zhì)沉淀的有機(jī)溶劑的濃度不同，因此控制有機(jī)溶劑濃度也可以分離純化蛋白質(zhì)。有機(jī)溶劑引起蛋白質(zhì)沉淀的主要原因之一是改變了介質(zhì)的介電常數(shù)。有機(jī)

5、溶劑的加入使水溶液的介電常數(shù)降低。介電常數(shù)的降低將增加兩個(gè)相反電荷之間的吸引力。蛋白質(zhì)分子表面可解離基團(tuán)的離子化程度減弱，水化程度降低，因此促進(jìn)了蛋白質(zhì)分子的聚集和沉淀。水溶性非離子聚合物如聚乙二醇與蛋白質(zhì)親水集團(tuán)發(fā)生相互作用并在空間上阻礙了蛋白質(zhì)與水相接近。蛋白質(zhì)在聚乙二醇中的溶解度明顯的依賴于聚乙二醇的分子量。4、溫度對蛋白質(zhì)溶解度的影響：在一定溫度范圍內(nèi)，約0~40℃之間，大部分球狀蛋白的溶解度隨溫度升高而增加，在40~50℃以上，大部分蛋白質(zhì)變得不穩(wěn)定并開始變性，一般在中性pH介質(zhì)中即失去溶解力。大多數(shù)蛋白質(zhì)在低溫下

6、比較穩(wěn)定，因此蛋白質(zhì)的分級分離操作一般都在0℃或更低的溫度下進(jìn)行。（三）根據(jù)電荷不同根據(jù)蛋白質(zhì)的電荷不同即酸堿性質(zhì)不同分離蛋白質(zhì)混合物的方法有電泳和離子交換層析兩類。1、電泳：在外電場的作用下，帶點(diǎn)顆粒將向著與其電性相反的電極移動，這種現(xiàn)象稱為電泳。電泳技術(shù)可用于氨基酸、肽、蛋白質(zhì)和核苷酸等生物分子的分析分離和制備。區(qū)帶電泳是由于在支持物上電泳蛋白質(zhì)混合物被分離為若干區(qū)帶。電泳前用緩沖液浸潤薄膜或?yàn)V紙等支持物或用緩沖液直接配置成凝膠，將待分離的蛋白質(zhì)樣品加在它的一端或中央，支持物的兩端與電極連接，通電電泳。電泳完畢，各個(gè)組分

7、分布在不同的區(qū)域，用顯色劑（蛋白質(zhì)可用考馬斯亮藍(lán)或氨基黑等染色）顯色后可以顯示出各個(gè)組分。氨基酸混合物特別是寡聚核苷酸混合物一次電泳往往不能完全分開。這種情況可以將第一次電泳分開的斑點(diǎn)通過支持介質(zhì)間的接觸印跡轉(zhuǎn)移到第二個(gè)支持介質(zhì)上，旋轉(zhuǎn)90°，進(jìn)行第二次電泳。這種方法稱為雙向電泳。2、聚丙烯酰胺凝膠電泳：以聚丙烯酰胺凝膠為支持物，一般制成凝膠柱或凝膠板，凝膠是由相連的兩部分組成（小的部分是濃縮膠，大的部分為分離膠），這兩部分凝膠的濃度、緩沖液組分和離子強(qiáng)度、pH以及電場強(qiáng)度都是不同的，即不連續(xù)性。電泳時(shí)樣品首先在不連續(xù)的兩相

8、間積聚濃縮而成很薄的起始區(qū)帶，然后再進(jìn)行電泳分離。電泳有三種物理效應(yīng)：1、樣品的濃度效應(yīng)；2、凝膠對被分離分子的篩選效應(yīng)；3、一般電泳分離的電荷效應(yīng)。1、毛細(xì)管電泳：高效毛細(xì)管電泳、毛細(xì)管區(qū)帶電泳、自由溶液毛細(xì)管電泳、毛細(xì)管電泳，可分離氨基酸、肽、蛋白質(zhì)、DNA片段和核酸以及多種小分子，也