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《熒光條形碼標(biāo)記的單分子檢測技術(shù)》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、熒光條形碼標(biāo)記的單分子檢測技術(shù)是一種全新的高通量檢測基因表達譜、miRNA等分子的技術(shù)，其定量結(jié)果可與real-timePCR相媲美。由于它的高通量和高精確性填補了基因芯片和real-timePCR之間的技術(shù)空白，一經(jīng)問世大受歡迎，其檢測結(jié)果頻頻登載在nature、science、cell等頂級雜志上。NanoString公司研發(fā)的熒光條形碼標(biāo)記的單分子檢測技術(shù)最早誕生于LeroyHood博士創(chuàng)立的系統(tǒng)生物學(xué)研究所（InstituteforSystemsBiology,ISB），該技術(shù)因可大批量檢測多個樣本多個基因，且定量精準(zhǔn)而頗受矚目，2008年被《Na
2、tureTechnology》雜志以封面文章的形式報道，報道如下：基因表達譜的檢測目前有兩種方法：基因芯片和real-timePCR。但它們都需要逆轉(zhuǎn)錄或其它的酶促反應(yīng)，這在一定程度上增加了人為操作及實驗反應(yīng)的誤差。因此，Geiss等人研發(fā)了全新的直接測定讀取mRNA表達量的NanostringnCounter分析系統(tǒng)，無須逆轉(zhuǎn)錄及其它酶促反應(yīng)，只需100ng的總RNA即可檢測，具有極高的靈敏度和可重復(fù)性，它的出現(xiàn)成為科研工作者除基因芯片和real-timePCR之外的新選擇。NanostringnCounter儀器的實驗原理是設(shè)計出捕捉探針和報告探針兩種
3、探針，分別與靶mRNA結(jié)合。其中捕捉探針標(biāo)有生物素，用于將雜交復(fù)合物固定在cartridge板上；報告探針則帶有四色熒光集團，其不同的排列組合方式代表不同的基因。將總RNA與這兩種探針進行雜交、純化、固定，掃描報告探針尾部的熒光集團確定其捕獲的基因及其表達量。由于基因表達量的鑒定是由熒光集團的排列組合決定的，背景噪音不會影響基因的定量，因此該方法與基因芯片相比具有極高的靈敏度，可用來檢測極低豐度的mRNA，即使每個細胞只表達單個mRNA也能夠被檢測出來，且其精確性與real-timePCR相當(dāng)，但通量則比real-timePCR高得多。在Nanostrin
4、gnCounter儀器中設(shè)計的探針長約35-50個堿基，且mRNA要與捕捉探針和報告探針兩條探針同時結(jié)合才能被檢測到，從而降低了實驗的假陽性率。其中，標(biāo)有生物素的捕捉探針會與cartridge板上的親和鏈霉素結(jié)合，為雜交復(fù)合物的熒光掃描做準(zhǔn)備；報告探針之后則有6個熒光探針位點，用于四色熒光標(biāo)記，根據(jù)不同的排列組合，他們最多可標(biāo)記46，即4096個探針。排除容易混淆的熒光探針和需要做陽性對照和陰性對照的熒光探針，該儀器一次可標(biāo)記800個熒光探針做目標(biāo)mRNA的檢測。NanostringnCounter儀器已和Affymetrix芯片進行比較。經(jīng)過檢測一系列寬
5、動態(tài)范圍的mRNA表達，結(jié)果顯示兩者之間變異系數(shù)<20%，并且有些低豐度mRNA可在nanostringnCounter儀器中檢出而在Affymetrix芯片中檢測不出來。NanostringnCounter儀器和基因表達串聯(lián)分析（serialanalysisofgeneexpression,SAGE）技術(shù)相似，但nanostring有更多優(yōu)勢，例如液相雜交，高通量檢測，靶mRNA無須擴增。與real-timePCR相比，nanostring只需單步反應(yīng)，比real-timePCR操作更簡便，且通量也比real-timePCR更高。總之，Nanostrin
6、gnCounter儀器所需樣本更少、無需酶反應(yīng)、操作更簡便，是現(xiàn)有的表達譜檢測手段的重要補充。NanostringnCounter儀器一經(jīng)問世大受歡迎，并已在nature、science、cell等頂級雜志發(fā)表多篇文章，目前已將應(yīng)用擴展至miRNA、IncRNA、CNV和融合基因的檢測。我們會就一系列經(jīng)典應(yīng)用進行后續(xù)報道。Nanostring近年來發(fā)表的文章2012·PassalacquaK.D.etal.,Strand-SpecificRNA-SeqRevealsOrderedPatternsofSenseandAntisenseTranscriptio
7、ninBacillusanthracis.PloSOne.Volume7,Issue8,e43350.August22,2012·CataissonC.etal.,IL-1R–MyD88signalinginkeratinocytetransformationandcarcinogenesis.J.Exp.Med[Epubaheadofprint].August20,2012·DeardorffM.A.etal.,HDAC8mutationsinCorneliadeLangesyndromeaffectthecohesinacetylationcycle.
8、Nature[Epubaheadofprint].August12
