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《第三章 抗體的制備與純化技術》由會員上傳分享,免費在線閱讀,更多相關內容在教育資源-天天文庫。
1、大家下午好!第二篇分子免疫學技術授課內容一、特異性抗體的制備與純化技術二、蛋白質研究水平的分子免疫學技術四、基因組和蛋白質組研究水平的分子免疫學技術授課方式:講授、自學、演示相結合三、DNA研究水平的分子免疫學技術第三章特異性抗體的制備與純化技術緒論特異性抗體:多克隆抗體(抗血清)單克隆抗體(雜交瘤技術)基因工程抗體第一節(jié)多克隆抗體的制備與純化多克隆抗體:由某一抗原刺激機體后產生的抗體,實際上為針對該抗原分子表面不同抗原決定簇的抗體的混合物,即多克隆抗體。多克隆抗體(抗血清)的制備流程抗原半抗原+載體佐劑免疫動物(3-5
2、次)測效價動物采血,分離血清抗血清純化、鑒定、保存一、抗原制備1、抗原的制備1)細胞性抗原或顆粒性抗原:細胞性抗原主要包括人、動物的細胞,還有細菌、螺旋體及寄生蟲等。如菌體(O)抗原的制備:選擇標準菌株,接種于斜面或平板培養(yǎng)基表面;置溫箱37℃培養(yǎng)24h,用適量的無菌生理鹽水刮下菌苔,移入無菌含有玻璃珠的三角瓶中,充分搖勻菌體;100℃水裕2~2.5h殺菌并破會鞭毛抗原。取處理過的菌液,檢測有無活菌的存在,合格后用無菌生理鹽水稀釋成每毫升8億~10億個細菌,加入苯酚至最終濃度為5%,即為O抗原。2)可溶性抗原可溶性抗原主
3、要包括蛋白質、糖蛋白、脂蛋白、脂多糖、酶、補體、細菌外毒素、核酸等。它們大多數(shù)來源組織細胞,成分復雜。制備這類抗原時,首先需將組織和細胞破碎,然后再從組織和細胞勻漿中提取目的成分,提純后的抗原需鑒定后才能用做免疫原。(1)組織勻漿的制備:所有的組織必須是新鮮的或低溫保存的。器官或組織獲得后立即去除表面的包膜或結締組織以及大血管,在4℃水浴或冰浴中將洗凈的組織剪成小塊,加入適量生理鹽水,裝入搗碎機破碎制成組織勻漿。(2)細胞破碎:提取細胞可溶性抗原,需將細胞破碎,常用方法有冷熱交替法、超聲破碎法,反復凍融法、自溶法和酶處理
4、法等。超聲破碎:一次超聲1~2min,總時間為10~15min。(3)蛋白提純①超速離心法:常用密度梯度介質有蔗糖、甘油、CsCl;②選擇性沉淀法(鹽析沉淀法):其原理是根據(jù)蛋白質理化特性的差異,采用各種沉淀劑或改變某些條件促使蛋白質抗原成分沉淀,從而達到純化的目的。如選用33~50%飽和度的硫酸胺收集沉淀物;③凝膠層析法(分子篩層析):蛋白質分子按大小被分離;④離子交換層析;帶電的生物大分子和離子交換色譜填料上的離子基團進行交換而被分離純化。以離子交換劑為固定相,依據(jù)流動相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進行可逆交換時
5、的結合力大小的差別而進行分離⑤親和層析:利用生物大分子的生物特異性如抗原抗體、激素受體、IgG和葡糖球菌蛋白蛋白A(SPA);⑥制備電泳技術。⑦其它聚丙烯酰胺凝膠膠內蛋白可將抗原所在的電泳條帶(或蛋白點)切下,研磨后直接用以動物免疫。NC膜結合蛋白將含目的分子的蛋白進行SDS-PAGE電泳,轉移至NC膜上,麗春紅顯色至清晰顯示目的條帶,取目的條帶置于加有PBS的1.5ml離心管中,用PBS洗至無色,繼而剪碎、研磨,用于動物免疫。(4)純化抗原的鑒定含量測定:采用常規(guī)蛋白或糖類濃度測定法,一般采用分光光度計測量法;相對分子
6、量的鑒定:一般采用SDS-PAGE電泳法;純度鑒定:常用區(qū)帶電泳法鑒定。3)半抗原半抗原物質多數(shù)為低分子質量的物質,如:多糖、多肽、甾體激素、脂肪胺、類脂質、核酸、某些藥物及其它化學藥品;常用載體:蛋白質類如:牛血清白蛋白、人血清清蛋白、兔血清清蛋白等。多肽聚合物:如多聚Lys大分子聚合物:如羥甲基纖維素;半抗原-載體連接方法:常用物理法和化學法,物理吸附的載體有羥甲基纖維素等,其借助電荷和微孔吸附半抗原,化學法則是利用某些功能基團把半抗原連接到載體上。2.佐劑1)定義:與抗原同時或預先注射于機體能增強機體免疫應答或改變
7、免疫類型的物質.2)良好的佐劑應當具備以下條件:(1)增加抗原的表面積,并改變抗原的活性基團構型,從而增強抗原的免疫原性;(2)佐劑與抗原混合能延長抗原在局部組織的存留時間,降低抗原的分解速度,使抗原緩慢釋放至淋巴系統(tǒng)中,持續(xù)刺激機體產生高滴度的抗體;(3)佐劑可以直接或間接激活免疫活性細胞并使之增生,從而增強了體液免疫;(4)具有無毒性或副作用低的特點。3)常用佐劑的種類和制備應用最多的是福氏佐劑和細胞因子佐劑福氏佐劑:不完全佐劑:液體石蠟+羊毛脂完全佐劑:液體石蠟+羊毛脂+卡介苗福氏佐劑:抗原=1:1乳化成“油包水”
8、乳液(乳化方法主要有研磨法和注射器混合法)。完全佐劑一般不連續(xù)2次使用細胞因子佐劑IL-2IL-1IFNrCSF等二、免疫血清的制備1、免疫動物的選擇和飼養(yǎng)選擇動物:哺乳類和禽類1)適齡、健壯、無感染2)抗原與免疫動物種屬關系:差異越遠越好3)抗血清量的需要:量大,選用馬、羊等大動物,量小,選用兔、豚鼠4)實驗考慮: