第三章 抗體的制備與純化技術(shù)

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1、大家下午好！第二篇分子免疫學(xué)技術(shù)授課內(nèi)容一、特異性抗體的制備與純化技術(shù)二、蛋白質(zhì)研究水平的分子免疫學(xué)技術(shù)四、基因組和蛋白質(zhì)組研究水平的分子免疫學(xué)技術(shù)授課方式：講授、自學(xué)、演示相結(jié)合三、DNA研究水平的分子免疫學(xué)技術(shù)第三章特異性抗體的制備與純化技術(shù)緒論特異性抗體：多克隆抗體（抗血清）單克隆抗體（雜交瘤技術(shù)）基因工程抗體第一節(jié)多克隆抗體的制備與純化多克隆抗體：由某一抗原刺激機(jī)體后產(chǎn)生的抗體，實(shí)際上為針對(duì)該抗原分子表面不同抗原決定簇的抗體的混合物，即多克隆抗體。多克隆抗體（抗血清）的制備流程抗原半抗原+載體佐劑免疫動(dòng)物（3-5

2、次）測效價(jià)動(dòng)物采血，分離血清抗血清純化、鑒定、保存一、抗原制備1、抗原的制備1）細(xì)胞性抗原或顆粒性抗原：細(xì)胞性抗原主要包括人、動(dòng)物的細(xì)胞，還有細(xì)菌、螺旋體及寄生蟲等。如菌體（O）抗原的制備：選擇標(biāo)準(zhǔn)菌株，接種于斜面或平板培養(yǎng)基表面；置溫箱37℃培養(yǎng)24h，用適量的無菌生理鹽水刮下菌苔，移入無菌含有玻璃珠的三角瓶中，充分搖勻菌體；100℃水裕2～2.5h殺菌并破會(huì)鞭毛抗原。取處理過的菌液，檢測有無活菌的存在，合格后用無菌生理鹽水稀釋成每毫升8億～10億個(gè)細(xì)菌，加入苯酚至最終濃度為5％，即為O抗原。2）可溶性抗原可溶性抗原主

3、要包括蛋白質(zhì)、糖蛋白、脂蛋白、脂多糖、酶、補(bǔ)體、細(xì)菌外毒素、核酸等。它們大多數(shù)來源組織細(xì)胞，成分復(fù)雜。制備這類抗原時(shí)，首先需將組織和細(xì)胞破碎，然后再從組織和細(xì)胞勻漿中提取目的成分，提純后的抗原需鑒定后才能用做免疫原。（1）組織勻漿的制備：所有的組織必須是新鮮的或低溫保存的。器官或組織獲得后立即去除表面的包膜或結(jié)締組織以及大血管，在4℃水浴或冰浴中將洗凈的組織剪成小塊，加入適量生理鹽水，裝入搗碎機(jī)破碎制成組織勻漿。（2）細(xì)胞破碎：提取細(xì)胞可溶性抗原，需將細(xì)胞破碎，常用方法有冷熱交替法、超聲破碎法，反復(fù)凍融法、自溶法和酶處理

4、法等。超聲破碎：一次超聲1～2min，總時(shí)間為10～15min。（3）蛋白提純①超速離心法：常用密度梯度介質(zhì)有蔗糖、甘油、CsCl；②選擇性沉淀法（鹽析沉淀法）：其原理是根據(jù)蛋白質(zhì)理化特性的差異，采用各種沉淀劑或改變某些條件促使蛋白質(zhì)抗原成分沉淀，從而達(dá)到純化的目的。如選用33～50％飽和度的硫酸胺收集沉淀物；③凝膠層析法（分子篩層析）：蛋白質(zhì)分子按大小被分離；④離子交換層析；帶電的生物大分子和離子交換色譜填料上的離子基團(tuán)進(jìn)行交換而被分離純化。以離子交換劑為固定相，依據(jù)流動(dòng)相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進(jìn)行可逆交換時(shí)

5、的結(jié)合力大小的差別而進(jìn)行分離⑤親和層析：利用生物大分子的生物特異性如抗原抗體、激素受體、IgG和葡糖球菌蛋白蛋白A（SPA）；⑥制備電泳技術(shù)。⑦其它聚丙烯酰胺凝膠膠內(nèi)蛋白可將抗原所在的電泳條帶（或蛋白點(diǎn)）切下,研磨后直接用以動(dòng)物免疫。NC膜結(jié)合蛋白將含目的分子的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至NC膜上，麗春紅顯色至清晰顯示目的條帶，取目的條帶置于加有PBS的1.5ml離心管中，用PBS洗至無色，繼而剪碎、研磨，用于動(dòng)物免疫。（4）純化抗原的鑒定含量測定：采用常規(guī)蛋白或糖類濃度測定法，一般采用分光光度計(jì)測量法；相對(duì)分子

6、量的鑒定：一般采用SDS-PAGE電泳法；純度鑒定：常用區(qū)帶電泳法鑒定。3）半抗原半抗原物質(zhì)多數(shù)為低分子質(zhì)量的物質(zhì)，如：多糖、多肽、甾體激素、脂肪胺、類脂質(zhì)、核酸、某些藥物及其它化學(xué)藥品；常用載體：蛋白質(zhì)類如：牛血清白蛋白、人血清清蛋白、兔血清清蛋白等。多肽聚合物：如多聚Lys大分子聚合物：如羥甲基纖維素；半抗原－載體連接方法：常用物理法和化學(xué)法，物理吸附的載體有羥甲基纖維素等，其借助電荷和微孔吸附半抗原，化學(xué)法則是利用某些功能基團(tuán)把半抗原連接到載體上。2.佐劑1）定義：與抗原同時(shí)或預(yù)先注射于機(jī)體能增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答或改變

7、免疫類型的物質(zhì).2）良好的佐劑應(yīng)當(dāng)具備以下條件：（1）增加抗原的表面積，并改變抗原的活性基團(tuán)構(gòu)型，從而增強(qiáng)抗原的免疫原性；（2）佐劑與抗原混合能延長抗原在局部組織的存留時(shí)間，降低抗原的分解速度，使抗原緩慢釋放至淋巴系統(tǒng)中，持續(xù)刺激機(jī)體產(chǎn)生高滴度的抗體；（3）佐劑可以直接或間接激活免疫活性細(xì)胞并使之增生，從而增強(qiáng)了體液免疫；（4）具有無毒性或副作用低的特點(diǎn)。3）常用佐劑的種類和制備應(yīng)用最多的是福氏佐劑和細(xì)胞因子佐劑福氏佐劑：不完全佐劑:液體石蠟+羊毛脂完全佐劑:液體石蠟+羊毛脂+卡介苗福氏佐劑：抗原=1：1乳化成“油包水”

8、乳液（乳化方法主要有研磨法和注射器混合法）。完全佐劑一般不連續(xù)2次使用細(xì)胞因子佐劑IL-2IL-1IFNrCSF等二、免疫血清的制備1、免疫動(dòng)物的選擇和飼養(yǎng)選擇動(dòng)物:哺乳類和禽類1)適齡、健壯、無感染2）抗原與免疫動(dòng)物種屬關(guān)系：差異越遠(yuǎn)越好3）抗血清量的需要：量大，選用馬、羊等大動(dòng)物，量小，選用兔、豚鼠4）實(shí)驗(yàn)考慮：