衰老細胞中調(diào)控胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白3的表達

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1、衰老細胞中調(diào)控胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白3的表達：任文君,王群義,呂小鳳,毛澤斌,蔣曉剛【摘要】目的:研究在衰老細胞中調(diào)控胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白3（IGFBP3）表達增加的影響因素。方法:用Northernblot的方法顯示IGFBP3基因的表達在年輕和衰老的2BS細胞中存在差異;PCR擴增出人類IGFBP3上游包括5′UTR區(qū)的2kb的序列并用酶切得到4組不同長短的IGFBP3啟動子片段;將各片段用EffecteneTransfectionReagent試劑盒轉(zhuǎn)染到年輕和衰老細胞中,測出幾組構(gòu)建基因片段的啟動活性,確定可調(diào)控轉(zhuǎn)錄活性

2、的區(qū)域;通過重疊寡核苷酸凝膠阻滯實驗確定在該活性區(qū)域中的增強子元件。結(jié)果:與年輕的2BS細胞相比,衰老的2BS細胞中IGFBP3基因的表達升高;在IGFBP3啟動子+59到-58序列之間存在著蛋白結(jié)合位點;5′ccagcctgccaagcagcgtgccccggttgc3′是IGFBP3的增強子元件。結(jié)論:在衰老的2BS細胞中IGFBP3基因上游-37到-8的30bp序列存在一個新的增強子元件IEE(IGFBP3enhancerelement),對IGFBP3的表達起到調(diào)控作用。【關(guān)鍵詞】胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白3;IEE(IG

3、FBP3enhancerelement);2BS細胞［Abstract］AIM:TostudytheinfluencingfactorsoftheincreasedexpressionofthecontrollinginsulingroanIGFBP3upstreamsequenceincludingtheseriesofthe5′UTRareaplifiedbyPCR,andfourgroupsofIGFBP3promoterfragmentsofdifferentlengthsedigestion.TheEffecteneTransfe

4、ctionReagent(Qiagen)kitentsintotheyoungandsenescentcells.Thepromotingactivityofseveralgroupsofconstructinggenefragmentsined.Theenhancerelementintheactivityareaposingtheoligonucleotidegelblockingexperiment.RESULTS:paredentsitefromsite+59to58oftheIGFBP3enhancer.5′ccagcctgcca

5、agcagcgtgccccggttgc3′entofIGFBP3.CONCLUSION:Inthe30bpfragmentfromsite37to8oftheIGFBP3geneupstream,thereisaneentIEE,ent);2BScells胰島素樣生長因子（insulingroacI,XhoI,SmaI,NheI,BglII,pGEMTEasy質(zhì)粒,Corefootprintingsystemkit均購于Promega公司;RNA提取試劑盒RNeasytotalRNAkit和轉(zhuǎn)染試劑盒EffecteneTransfec

6、tionReagent購于Qiagen公司;［γ32P］ATP購于北京福瑞公司;poly(dIdC)購于AmershamPharmaciaBiotech公司。1.2方法1.2.1Northernblot檢測用RNeasytotalRNA試劑盒提取總RNA。DNA片段通過randomprimingkit(Promega,Madison,hybridizationsolution(Clontech)進行雜交,放射自顯影。1.2.2IGFBP3基因5′調(diào)控區(qū)片段的構(gòu)建用高保真Taq酶擴增出人類IGFBP3上游包括5′UTR區(qū)的2kb的序列。上游引

7、物是:5′GCTAGCACCTGGGACCTCAAGAATTGCATTT3′,（5′端加入了NheI酶切位點）;下游引物是:5′AGATCTCGGAGCAGCACCAGCAGAGTCAG3′,（5′端加入了BglII切位點）。將擴增片段轉(zhuǎn)化到pGEMTEasy質(zhì)粒當中(Promega),并進一步轉(zhuǎn)化到pGL3Basic質(zhì)粒中,用限制性內(nèi)切酶從5′端對片段進行酶切,酶切位點分別在-1303（SacII）、-778（PmacI）、-305（XhoI）、-141（SmaI）,這樣用SacII/NheI、PmacI/NheI、XhoI/NheI和S

8、maI/NheI酶切得到四組不同長短的IGFBP3啟動子片段。將酶切后的質(zhì)粒用T4DNA酶進行酶切,并用T4連接酶連接,將連接好的幾組