枸骨內(nèi)生真菌抗菌活性成分的分離、鑒定與應用分析

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1、·獨創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的論文是我個人在導師指導下進行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標注和致謝的地方外，論文中不包括其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果。對本研究做過貢獻的老師和同學均己在論文中作了明確的說明并表示了謝意。日期：2009年6月1日關于論文使用授權說明本人完全了解杭州師范大學有關保留、使用學位論文的規(guī)定，即：學校有權保留送交論文的復印件，允許論文被查閱和借閱;學?？梢怨颊撐牡娜炕虿糠謨?nèi)容，可以采用影印、縮印或其他手段保存論文。日期：2009年6月1日····杭州師范大學枸骨內(nèi)生真菌抗菌活性成分的分離、鑒定及應用研究摘要本論文通

2、過系統(tǒng)篩選，從植物枸骨（LlexcornutaLindl.）中分離到的一株具有高抗菌活性的內(nèi)生真菌，并以此作為研究對象，對該內(nèi)生真菌進行了種屬鑒定，并對其代謝產(chǎn)物中主要活性成分進行了提取、分離和結(jié)構解析；在此基礎上研究了主要活性成分的分析檢測方法和抑菌作用，通過紫外誘變選育出高效活性生產(chǎn)菌株，運用隨機擴展多態(tài)性DNA（RAPD）技術對該菌及其誘變體進行DNA多態(tài)性分析，最后對活性成分的安全性和藥效進行了評價。主要研究結(jié)果如下：（1）枸骨內(nèi)生真菌的屬種鑒定：根據(jù)形態(tài)培養(yǎng)特征和生理生化特征，對照《真菌鑒定手冊》將該內(nèi)生真菌初步歸屬為木霉屬真菌哈茨木霉（Trichoder

3、maharzianumRifai），將其命名為哈茨木霉菌株L。（2）哈茨木霉菌株L的代謝產(chǎn)物的主要抗菌活性成分：分離純化得到哈茨木霉菌株L代謝產(chǎn)物的主要抗菌活性成分，經(jīng)IR、MS和NMR光譜分析確定為一倍半萜類化合物，英文名稱為：trichodermin，化學名稱：4β-乙?；?12，13-環(huán)氧-9-單端孢霉烯。并且建立了該物質(zhì)的氣相色譜分析方法。（3）活性物質(zhì)trichodermin的抑菌活性：室內(nèi)毒力測定結(jié)果表明，Trichodermin對9種植物病原真菌的菌絲生長和2種植物病原真菌孢子的萌發(fā)均有不同程度的抑制作用。其中對水稻紋枯病菌[Thanatephorus

4、cucumeris（Frank）Donk]和黃瓜立枯病菌（RhizoctoniasolaniKüehn）有較好的毒力，其EC50值分別為0.7071μg/mL和0.3253μg/mL；對番茄灰霉病菌（BotrytiscinereaPers）和番茄早疫病[Alternariasolani（EllisetMartin）JonesetGrout.]，毒力作用次之，其EC50值分別為3.7287μg/mL和10.6772μg/mL；對黃瓜枯萎病菌（Fusariumoxysporumf.sp.cucumerinumOwen）、西瓜枯萎病菌（Fusariumoxysporium

5、f.sp.niveum）、菜豆炭疽病菌[Colletotrichumlindemuthianum（sacc.etMagn.）Br.etCav.]和葡萄炭疽病菌[Colletotrichumgloeosporioides（Penz.）Sacc.]的毒力相對較弱，其EC50值分別為23.4072、41.6013、33.0261和28.6393μg/mL；對水稻胡麻斑病菌[Cochliobolusmiyabeanus（Ito&Kuribayashi）]的毒力最差（>800μg/mL）。對黃瓜枯萎病菌（F.oxysporumf.sp.cucumerinum）和西瓜枯萎病菌（

6、F.oxysporiumf.sp.niveum）孢子萌發(fā)的抑制作用EC50分別為2.2209和2.2905μg/mL?；铙w試驗結(jié)果表明，Trichodermin濃度為100mg/L時，對番茄早疫病（A.solani）及黃瓜立枯?。≧..solani）的保護效果達97.8%和98.1%，治療效果達96.7%和97.3%。（4）Trichodermin制劑的藥效、安全性及毒理學研究：盆栽試驗結(jié)果表明，Trichodermin1000倍液對黃瓜立枯?。≧..solani）有良好的治療和保護作用，7天后保護防效和治療防效分別為88.89%和95.83%；Trichoderm

7、in在番茄及土壤中降解較快，殘留極低，施藥后的第10天trichodermin在番茄中的殘留量僅0.0054mg/kg，在土壤中的殘留量僅為0.0013mg/kg；Ⅰ····杭州師范大學枸骨內(nèi)生真菌抗菌活性成分的分離、鑒定及應用研究經(jīng)毒理學研究發(fā)現(xiàn)，Trichodermin原藥產(chǎn)品對哺乳類動物十分安全，按GB15670-1995《農(nóng)藥登記毒理學試驗方法》的分級標準該農(nóng)藥的原藥屬低毒。（5）高效菌株的選育及誘變前后菌株RAPD分析：以哈茨木霉菌株L作為出發(fā)菌株，進行紫外線二次復合誘變處理，通過初篩和復篩，獲得一株高產(chǎn)突變株UV-5-3，其產(chǎn)素水平為164.75μg