枸骨內(nèi)生真菌抗菌活性成分的分離、鑒定與應(yīng)用研究

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1、獨(dú)創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的論文是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包括其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果。對(duì)本研究做過貢獻(xiàn)的老師和同學(xué)均己在論文中作了明確的說明并表示了謝意。日期：2009年6月1日關(guān)于論文使用授權(quán)說明本人完全了解杭州師范大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：學(xué)校有權(quán)保留送交論文的復(fù)印件，允許論文被查閱和借閱;學(xué)?？梢怨颊撐牡娜炕虿糠謨?nèi)容，可以采用影印、縮印或其他手段保存論文。日期：2009年6月1日杭州師范大學(xué)枸骨內(nèi)生真菌抗菌活性成分的分離、鑒定及應(yīng)用研究摘要本論文通過系統(tǒng)篩選，從植物枸骨（L

2、lexcornutaLindl.）中分離到的一株具有高抗菌活性的內(nèi)生真菌，并以此作為研究對(duì)象，對(duì)該內(nèi)生真菌進(jìn)行了種屬鑒定，并對(duì)其代謝產(chǎn)物中主要活性成分進(jìn)行了提取、分離和結(jié)構(gòu)解析；在此基礎(chǔ)上研究了主要活性成分的分析檢測(cè)方法和抑菌作用，通過紫外誘變選育出高效活性生產(chǎn)菌株，運(yùn)用隨機(jī)擴(kuò)展多態(tài)性DNA（RAPD）技術(shù)對(duì)該菌及其誘變體進(jìn)行DNA多態(tài)性分析，最后對(duì)活性成分的安全性和藥效進(jìn)行了評(píng)價(jià)。主要研究結(jié)果如下：（1）枸骨內(nèi)生真菌的屬種鑒定：根據(jù)形態(tài)培養(yǎng)特征和生理生化特征，對(duì)照《真菌鑒定手冊(cè)》將該內(nèi)生真菌初步歸屬為木霉屬真菌哈茨木霉（TrichodermaharzianumRifai），將其命

3、名為哈茨木霉菌株L。（2）哈茨木霉菌株L的代謝產(chǎn)物的主要抗菌活性成分：分離純化得到哈茨木霉菌株L代謝產(chǎn)物的主要抗菌活性成分，經(jīng)IR、MS和NMR光譜分析確定為一倍半萜類化合物，英文名稱為：trichodermin，化學(xué)名稱：4β-乙?；?12，13-環(huán)氧-9-單端孢霉烯。并且建立了該物質(zhì)的氣相色譜分析方法。（3）活性物質(zhì)trichodermin的抑菌活性：室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果表明，Trichodermin對(duì)9種植物病原真菌的菌絲生長和2種植物病原真菌孢子的萌發(fā)均有不同程度的抑制作用。其中對(duì)水稻紋枯病菌[Thanatephoruscucumeris（Frank）Donk]和黃瓜立枯病菌（

4、RhizoctoniasolaniKüehn）有較好的毒力，其EC50值分別為0.7071μg/mL和0.3253μg/mL；對(duì)番茄灰霉病菌（BotrytiscinereaPers）和番茄早疫病[Alternariasolani（EllisetMartin）JonesetGrout.]，毒力作用次之，其EC50值分別為3.7287μg/mL和10.6772μg/mL；對(duì)黃瓜枯萎病菌（Fusariumoxysporumf.sp.cucumerinumOwen）、西瓜枯萎病菌（Fusariumoxysporiumf.sp.niveum）、菜豆炭疽病菌[Colletotrichumlin

5、demuthianum（sacc.etMagn.）Br.etCav.]和葡萄炭疽病菌[Colletotrichumgloeosporioides（Penz.）Sacc.]的毒力相對(duì)較弱，其EC50值分別為23.4072、41.6013、33.0261和28.6393μg/mL；對(duì)水稻胡麻斑病菌[Cochliobolusmiyabeanus（Ito&Kuribayashi）]的毒力最差（>800μg/mL）。對(duì)黃瓜枯萎病菌（F.oxysporumf.sp.cucumerinum）和西瓜枯萎病菌（F.oxysporiumf.sp.niveum）孢子萌發(fā)的抑制作用EC50分別為2.220

6、9和2.2905μg/mL?；铙w試驗(yàn)結(jié)果表明，Trichodermin濃度為100mg/L時(shí)，對(duì)番茄早疫病（A.solani）及黃瓜立枯?。≧..solani）的保護(hù)效果達(dá)97.8%和98.1%，治療效果達(dá)96.7%和97.3%。（4）Trichodermin制劑的藥效、安全性及毒理學(xué)研究：盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，Trichodermin1000倍液對(duì)黃瓜立枯?。≧..solani）有良好的治療和保護(hù)作用，7天后保護(hù)防效和治療防效分別為88.89%和95.83%；Trichodermin在番茄及土壤中降解較快，殘留極低，施藥后的第10天trichodermin在番茄中的殘留量?jī)H0.005

7、4mg/kg，在土壤中的殘留量?jī)H為0.0013mg/kg；Ⅰ杭州師范大學(xué)枸骨內(nèi)生真菌抗菌活性成分的分離、鑒定及應(yīng)用研究經(jīng)毒理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，Trichodermin原藥產(chǎn)品對(duì)哺乳類動(dòng)物十分安全，按GB15670-1995《農(nóng)藥登記毒理學(xué)試驗(yàn)方法》的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)該農(nóng)藥的原藥屬低毒。（5）高效菌株的選育及誘變前后菌株RAPD分析：以哈茨木霉菌株L作為出發(fā)菌株，進(jìn)行紫外線二次復(fù)合誘變處理，通過初篩和復(fù)篩，獲得一株高產(chǎn)突變株UV-5-3，其產(chǎn)素水平為164.75μg/mL，是原始菌株