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《lps誘導(dǎo)小鼠肺巨噬細胞氧化應(yīng)激在自噬中的作用機制研究》由會員上傳分享,免費在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、LPS誘導(dǎo)小鼠肺巨噬細胞氧化應(yīng)激在自噬中的作用機制研究摘要目的:觀察脂多糖(Lippolysaccride,LPS)對外源性過氧化氫(H2O2)刺激的小鼠肺巨噬細胞(Ana-1)的氧化損傷的影響,并通過Ana-1細胞DNA氧化損傷和自噬角度來研究LPS誘導(dǎo)對Ana-1細胞氧化應(yīng)激和自噬的作用機制及其相關(guān)的分子機制。方法:1.LPS刺激Ana-1細胞模型的建立及LPS誘導(dǎo)下Ana-1細胞氧化應(yīng)激損傷模型的影響。LPS作用于Ana-1細胞,彗星實驗試劑盒檢測Ana-1細胞DNA損傷的情況,ROS熒光探針-DHE檢測Ana-1細胞內(nèi)活性氧族物質(zhì)(ReactiveOxygenSpec
2、ies,ROS)的表達情況,總SOD活性檢測試劑盒(WST法)檢測Ana-1細胞總超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase,SOD)的表達情況。LPS作用于氧化應(yīng)激損傷下的Ana-1細胞,通過彗星實驗試劑盒檢測Ana-1細胞DNA損傷的情況,ROS熒光探針-DHE檢測Ana-1細胞ROS的表達情況,總SOD活性檢測試劑盒(WST法)檢測Ana-1細胞總SOD的表達情況。比較LPS作用于Ana-1細胞與LPS作用氧化應(yīng)激狀態(tài)下的Ana-1細胞的指標(biāo)變化情況。2.LPS作用下的Ana-1細胞自噬現(xiàn)象和LPS作用于氧化應(yīng)激損傷下的Ana-1細胞自噬現(xiàn)象。LPS濃度為1
3、ug/ml刺激Ana-1細胞4小時后(LPS處理組),逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測自噬相關(guān)因子LC3-Ⅱ的mRNA表達水平變化,脂質(zhì)體Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染質(zhì)粒GFP-LC3(greenfluorescentprotein-microtubuleassociatedproteinlightchain3,綠色熒光蛋白-微管相關(guān)蛋白1輕鏈3)和質(zhì)粒RFP-LC3(Redfluorescentprotein-microtubuleassociatedproteinlightchain3,紅色熒光蛋白-微管相關(guān)蛋白1輕鏈3)觀察LPS作用下的Ana-1細胞
4、的自噬現(xiàn)象,免疫蛋白印記(WesternBlot)法檢測自噬基因BECN1蛋白和LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白的表達。LPS作用氧化應(yīng)激狀態(tài)下的Ana-1細胞(LPS+H2O2處理組,外源性H2O2濃度為12.5uM刺激Ana-1細胞2h后,再加入LPS濃度為1ug/ml刺激Ana-1細胞4h),RT-PCR法檢測自噬相關(guān)因子LC3的mRNA表達水平變化,脂質(zhì)體Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染質(zhì)粒GFP-LC3和質(zhì)粒RFP-LC3觀察自噬現(xiàn)象,WesternBlot法檢測自噬基因BECN1蛋白和LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白表達。維生素C抗氧化應(yīng)激損傷處理后(維生素C濃度為2000ug/ml,刺激
5、1小時后加入H2O2,濃度為12.5uM刺激Ana-1細胞2h后,再加入LPS濃度為1ug/ml刺激Ana-1細胞4h)觀察LPS介導(dǎo)下Ana-1細胞的自噬現(xiàn)象以及WesternBlot法檢測自噬基因BECN1蛋白和LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白表達。對照組用PBS刺激進行對比。比較對照組、LPS處理組和LPS+H2O2處理組以及維生素C處理組兩兩間所測指標(biāo)的變化和差異。結(jié)果:1.LPS作用于Ana-1細胞,與對照組相比較,細胞內(nèi)ROS的表達濃度增高,P<0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義;總SOD的表達減少,P<0.01具有統(tǒng)計學(xué)意義;彗星實驗檢測出Ana-1細胞DNA有損傷,P<0.01具有統(tǒng)計學(xué)
6、意義提示LPS處理可誘導(dǎo)Ana-1細胞的氧化應(yīng)激損傷。LPS處理后氧化應(yīng)激狀態(tài)下的Ana-1細胞內(nèi)的ROS的表達濃度較LPS處理組明顯增高,P<0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義;總SOD的表達減少,P<0.01具有統(tǒng)計學(xué)意義;彗星實驗檢測出Ana-1細胞DNA有損傷,P<0.01具有統(tǒng)計學(xué)意義,細胞損傷明顯。2.共聚焦顯微鏡下觀察對照組、LPS處理組、LPS+H2O2處理組的ROS熒光強度和熒光數(shù)量發(fā)現(xiàn):LPS處理組的ROS熒光強度和熒光數(shù)量與對照組相比較有所增加,P<0.01具有統(tǒng)計學(xué)意義;LPS+H2O2處理組的ROS熒光強度和熒光數(shù)量較LPS處理組明顯增加,P<0.01具有統(tǒng)計學(xué)
7、意義。3.RT-PCR法檢測自噬相關(guān)因子LC3-Ⅱ的mRNA表達水平變化示LPS+H2O2處理組較LPS處理組的LC3-Ⅱ的mRNA表達水平量多;LPS處理組較對照組的LC3-Ⅱ的mRNA表達水平量多。4.共聚焦顯微鏡下觀察對照組、LPS處理組、LPS+H2O2處理組和維生素C處理組的細胞自噬GFP-LC3和RFP-LC3轉(zhuǎn)染情況發(fā)現(xiàn)LPS處理組較對照組的自噬小體有所增加;LPS+H2O2處理組較LPS處理組的自噬小體在胞質(zhì)內(nèi)表達明顯增加;維生素C處理組較LPS+H2O2處理組的自噬小體有所減少。5.W