lps誘導(dǎo)小鼠肺巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激在自噬中的作用機(jī)制研究

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1、LPS誘導(dǎo)小鼠肺巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激在自噬中的作用機(jī)制研究摘要目的：觀察脂多糖（Lippolysaccride,LPS）對外源性過氧化氫（H2O2）刺激的小鼠肺巨噬細(xì)胞（Ana-1）的氧化損傷的影響，并通過Ana-1細(xì)胞DNA氧化損傷和自噬角度來研究LPS誘導(dǎo)對Ana-1細(xì)胞氧化應(yīng)激和自噬的作用機(jī)制及其相關(guān)的分子機(jī)制。方法：1.LPS刺激Ana-1細(xì)胞模型的建立及LPS誘導(dǎo)下Ana-1細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型的影響。LPS作用于Ana-1細(xì)胞，彗星實(shí)驗(yàn)試劑盒檢測Ana-1細(xì)胞DNA損傷的情況，ROS熒光探針-DHE檢測Ana-1細(xì)胞內(nèi)活性氧族物質(zhì)（ReactiveOxygenSpec

2、ies,ROS）的表達(dá)情況，總SOD活性檢測試劑盒（WST法）檢測Ana-1細(xì)胞總超氧化物歧化酶（SuperoxideDismutase,SOD）的表達(dá)情況。LPS作用于氧化應(yīng)激損傷下的Ana-1細(xì)胞，通過彗星實(shí)驗(yàn)試劑盒檢測Ana-1細(xì)胞DNA損傷的情況，ROS熒光探針-DHE檢測Ana-1細(xì)胞ROS的表達(dá)情況，總SOD活性檢測試劑盒（WST法）檢測Ana-1細(xì)胞總SOD的表達(dá)情況。比較LPS作用于Ana-1細(xì)胞與LPS作用氧化應(yīng)激狀態(tài)下的Ana-1細(xì)胞的指標(biāo)變化情況。2.LPS作用下的Ana-1細(xì)胞自噬現(xiàn)象和LPS作用于氧化應(yīng)激損傷下的Ana-1細(xì)胞自噬現(xiàn)象。LPS濃度為1

3、ug/ml刺激Ana-1細(xì)胞4小時(shí)后（LPS處理組），逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法檢測自噬相關(guān)因子LC3-Ⅱ的mRNA表達(dá)水平變化，脂質(zhì)體Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染質(zhì)粒GFP-LC3（greenfluorescentprotein-microtubuleassociatedproteinlightchain3，綠色熒光蛋白-微管相關(guān)蛋白1輕鏈3）和質(zhì)粒RFP-LC3（Redfluorescentprotein-microtubuleassociatedproteinlightchain3，紅色熒光蛋白-微管相關(guān)蛋白1輕鏈3）觀察LPS作用下的Ana-1細(xì)胞

4、的自噬現(xiàn)象，免疫蛋白印記（WesternBlot）法檢測自噬基因BECN1蛋白和LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白的表達(dá)。LPS作用氧化應(yīng)激狀態(tài)下的Ana-1細(xì)胞（LPS+H2O2處理組，外源性H2O2濃度為12.5uM刺激Ana-1細(xì)胞2h后，再加入LPS濃度為1ug/ml刺激Ana-1細(xì)胞4h），RT-PCR法檢測自噬相關(guān)因子LC3的mRNA表達(dá)水平變化，脂質(zhì)體Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染質(zhì)粒GFP-LC3和質(zhì)粒RFP-LC3觀察自噬現(xiàn)象，WesternBlot法檢測自噬基因BECN1蛋白和LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白表達(dá)。維生素C抗氧化應(yīng)激損傷處理后(維生素C濃度為2000ug/ml,刺激

5、1小時(shí)后加入H2O2，濃度為12.5uM刺激Ana-1細(xì)胞2h后，再加入LPS濃度為1ug/ml刺激Ana-1細(xì)胞4h)觀察LPS介導(dǎo)下Ana-1細(xì)胞的自噬現(xiàn)象以及WesternBlot法檢測自噬基因BECN1蛋白和LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白表達(dá)。對照組用PBS刺激進(jìn)行對比。比較對照組、LPS處理組和LPS+H2O2處理組以及維生素C處理組兩兩間所測指標(biāo)的變化和差異。結(jié)果：1.LPS作用于Ana-1細(xì)胞，與對照組相比較，細(xì)胞內(nèi)ROS的表達(dá)濃度增高，P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；總SOD的表達(dá)減少，P<0.01具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；彗星實(shí)驗(yàn)檢測出Ana-1細(xì)胞DNA有損傷，P<0.01具有統(tǒng)計(jì)學(xué)

6、意義提示LPS處理可誘導(dǎo)Ana-1細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷。LPS處理后氧化應(yīng)激狀態(tài)下的Ana-1細(xì)胞內(nèi)的ROS的表達(dá)濃度較LPS處理組明顯增高，P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；總SOD的表達(dá)減少，P<0.01具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；彗星實(shí)驗(yàn)檢測出Ana-1細(xì)胞DNA有損傷，P<0.01具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，細(xì)胞損傷明顯。2.共聚焦顯微鏡下觀察對照組、LPS處理組、LPS+H2O2處理組的ROS熒光強(qiáng)度和熒光數(shù)量發(fā)現(xiàn)：LPS處理組的ROS熒光強(qiáng)度和熒光數(shù)量與對照組相比較有所增加，P<0.01具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；LPS+H2O2處理組的ROS熒光強(qiáng)度和熒光數(shù)量較LPS處理組明顯增加，P<0.01具有統(tǒng)計(jì)學(xué)

7、意義。3.RT-PCR法檢測自噬相關(guān)因子LC3-Ⅱ的mRNA表達(dá)水平變化示LPS+H2O2處理組較LPS處理組的LC3-Ⅱ的mRNA表達(dá)水平量多；LPS處理組較對照組的LC3-Ⅱ的mRNA表達(dá)水平量多。4.共聚焦顯微鏡下觀察對照組、LPS處理組、LPS+H2O2處理組和維生素C處理組的細(xì)胞自噬GFP-LC3和RFP-LC3轉(zhuǎn)染情況發(fā)現(xiàn)LPS處理組較對照組的自噬小體有所增加；LPS+H2O2處理組較LPS處理組的自噬小體在胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)明顯增加；維生素C處理組較LPS+H2O2處理組的自噬小體有所減少。5.W