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1、ZSTUZhejiangSci-TechUniversity碩士學(xué)位論文Master’sThesis中文論文題目:靶向NS3的抗登革病毒小分子抑制劑的發(fā)現(xiàn)及作用機(jī)制研究英文論文題目:DiscoveryandmechanisminvestigationofsmallmolecularinhibitortargetingDenguevirusNS3pro學(xué)科專業(yè)：生態(tài)學(xué)作者姓名：吳登偉導(dǎo)師姓名：許傳蓮遞交日期：2015年1月7日浙江理工大學(xué)學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他
2、人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過(guò)的研究成果，也不包含為獲得浙江理工大學(xué)或其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過(guò)的材料。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說(shuō)明并表示謝意。:位論文作者簽名年月日/簽字曰期：學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書太舉仿
3、女作者完全了解浙江理工大學(xué)有權(quán)保留并向國(guó)家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交本論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱。太人播叔浙江理工大學(xué)可以將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索和傳播，可以釆用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保農(nóng)Tli學(xué)女、（保密的學(xué)位i文在解密后適用本授權(quán)書）簽字日期：W年5月H日導(dǎo)師簽名：簽字曰期：年J月八曰浙江理工大學(xué)碩士學(xué)位
4、論文靶向NS3的抗登革病毒小分子抑制劑的發(fā)現(xiàn)及作用機(jī)制研究摘要登革病毒（Denguevirus，DENV）是一類在熱帶與亞熱帶地區(qū)廣泛流行的病原體，其與黃熱病毒（YFV），乙型腦炎病毒（JEV）和西尼羅河病毒（WNV）等同屬于黃病毒屬家族。登革病毒包括DENV-1，DENV-2，DENV-3，DENV-4四種血清型，其中以DENV-2最為流行。人感染其中任意一型登革病毒均會(huì)導(dǎo)致一系列嚴(yán)重的傳染疾病，如登革熱（Denguefever，DF），登革出血熱（Denguehemorrhagicfever，DHF）以及登革熱休克綜合征（Dengueshocksyndrome，DSS）。目
5、前，全球熱帶及亞熱帶地區(qū)每年大約有3.9億人被登革病毒感染，其中9600萬(wàn)人因此患病。截止目前為止人們尚未研制出有效的抗登革病毒藥物，此外疫苗的開(kāi)發(fā)也由于登革病毒本身具有的抗體依賴性感染增強(qiáng)作用（Antibodydependentenhancement，ADE）變得異常艱難。因此，尋找開(kāi)發(fā)出一種新的有效抗登革病毒藥物迫在眉睫。非結(jié)構(gòu)蛋白3（Non-structuralprotein3，NS3）是登革病毒所編碼的一種極為重要的蛋白，其N端是一種具有絲氨酸蛋白酶催化三聯(lián)體結(jié)構(gòu)的類胰蛋白酶。NS3主要參與登革病毒編碼的前體蛋白剪切，這對(duì)病毒的成熟以及復(fù)制均十分關(guān)鍵。NS3的蛋白酶活性
6、需要在NS2B的存在時(shí)才能被激活，作為輔因子的NS2B可以將NS3的酶活力提高3300-6600倍。由于復(fù)合蛋白NS2B/NS3pro（NS2B/NS3protease）對(duì)登革病毒成熟以及復(fù)制起著至關(guān)重要的作用，目前其已成為一個(gè)重要的抗登革病毒藥物開(kāi)發(fā)靶點(diǎn)。因此，NS2B/NS3pro的抑制劑的發(fā)現(xiàn)與作用機(jī)制研究具有十分重大的意義。本課題通過(guò)將pET15b-DENV-2-NS2B/NS3重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至EscherichiacoliBL21(DE3)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)NS2B/NS3pro；采用鎳柱親和層析法得到高純度的NS2B/NS3pro；利用高通量篩選平臺(tái)對(duì)實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)存化合物庫(kù)進(jìn)
7、行NS2B/NS3pro抑制劑的篩選；并用MTT比色法檢測(cè)NS2B/NS3pro候選抑制劑的細(xì)胞毒性；同時(shí)采用病毒復(fù)制子抑制實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)候選化合物對(duì)DENV-2病毒復(fù)制的抑制效果；最后綜合利用酶動(dòng)力學(xué)，表面等離子共振技術(shù)，差式掃描量熱法，紫外光譜法，分子模擬對(duì)接以及蛋白質(zhì)定點(diǎn)突變等技術(shù)方法原理對(duì)化合物抑制NS2B/NS3pro蛋白酶活性機(jī)制進(jìn)行研究，結(jié)果表明：NS2B/NS3pro抑制劑（化合物MT02A3101）具有極低的細(xì)胞毒性同時(shí)表現(xiàn)出良好的抑制登革病毒復(fù)制活性；MT02A3101作為一個(gè)NS2B/NS3pro的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑與NS2B/NS3pro底物結(jié)合口袋存在強(qiáng)烈的結(jié)合同
8、時(shí)使NS2B/NS3pro的熱穩(wěn)定性下降從而抑制其蛋白酶活性；此外還發(fā)現(xiàn)MT02A3101與NS2B/NS3pro的106位Gln，114位Gln，132位Thr及133位Arg生成氫鍵，同時(shí)與109I浙江理工大學(xué)碩士學(xué)位論文靶向NS3的抗登革病毒小分子抑制劑的發(fā)現(xiàn)及作用機(jī)制研究位Ile，115位Ile及131位Val存在疏水作用。關(guān)鍵字：登革病毒；NS2B/NS3pro抑制劑；作用機(jī)制；結(jié)合模型II浙江理工大學(xué)碩士學(xué)位論文靶向NS3的抗登革病毒小分子抑制劑的發(fā)現(xiàn)及作用機(jī)制研究Abstrac
