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《羊口瘡病毒安徽株的分離鑒定及其b2l基因的原核表達(dá)》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、摘要羊口瘡病毒又叫羊傳染性膿皰病病毒(ORFV)，該病毒屬于痘病毒科副痘病毒屬病毒。羊口瘡病毒具有較強(qiáng)的傳染性，主要感染綿羊和山羊等反芻動(dòng)物。近年來，逐漸有報(bào)道該病毒也可感染鹿、松鼠等野生動(dòng)物。世界各國和地區(qū)都有該病的報(bào)道，對(duì)養(yǎng)羊業(yè)造成較大危害和經(jīng)濟(jì)損失。除了疫苗接種外，該病尚未找到有效的治療手段，使用較多的疫苗是弱毒苗和滅活苗，二者在一定程度上能夠預(yù)防羊口瘡病，但存在病毒毒力返強(qiáng)、病毒變異等問題，效果并不理想，因此有必要找到更加有效的措施防范該病毒的傳播及危害。從中國安徽省亳州市某羊場采集疑似羊口瘡病口腔結(jié)痂病料，利用Hela細(xì)胞進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)，根
2、據(jù)NCBI上已公布的ORFVB2L基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，對(duì)特異性B2L基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增并送至生物公司測序，與已發(fā)表的其他毒株進(jìn)行序列比對(duì)，并構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹，確定基因進(jìn)化關(guān)系。將該基因克隆至原核表達(dá)載體pET-32a中，構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-32a-B2L，轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌BL21中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，用SDS-PAGE及Westernblot檢測目的蛋白及反應(yīng)原性，蛋白純化后，注射小鼠，制備多克隆抗體保存?zhèn)溆?。結(jié)果顯示，將該病毒接種到Hela細(xì)胞后，3～4天產(chǎn)生細(xì)胞病變，細(xì)胞表現(xiàn)為脫落、圓縮等特征；PCR顯示，在1137bp處有一明顯的特異
3、性條帶，與目的片段長度一致，與參考序列比對(duì)，同源性達(dá)到99%，系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹表明該分離株與遼寧分離株HQ694773的親緣關(guān)系最近，說明成功分離到一株羊口瘡病毒，將其命名為ORFV-AH分離株。本試驗(yàn)成功表達(dá)了B2L重組蛋白，該蛋白以包涵體形式存在，SDS-PAGE分析表明蛋白約為55kDa，最佳誘導(dǎo)條件為溫度37℃、時(shí)間4h，IPTG終濃度為1mmol/L，Westernblot分析表明表達(dá)產(chǎn)物具有良好的免疫活性。本試驗(yàn)提供了一種羊口瘡病毒的檢驗(yàn)方法，為安徽省羊口瘡病毒的防控提供了技術(shù)支撐。關(guān)鍵詞：羊口瘡病毒；分離鑒定；B2L；原核表達(dá)IAbstra
4、ctOrfvirusisalsocalledcontagiousecthyma，whichisanhighlyaddictedepithelialandhighlycontagiousdiseaseofsheepandgoat.OrfvirusisincludedinthePara-poxvirusgenusofthePoxvindaefamily.Orfvirusdistributedallovertheworld,whichcapturedpeople'attentionrecentyears.Attenuatedvaccineandinactiv
5、atedvaccineisusedmostwidelytopreventfromthisdisease.ButvirμLencereturnandtheemergenceofvirusvariantsinsecuritywereoftenhappened.Soitisnecessarytofindsomemeasurestopreventedthisdisease.OrfviruswasisolatedfromthesuspiciousscabmaterialsoflambswhichwascollectedfromAnhui.Helacellwasu
6、sedtoisolateOrfvirus.OnthebasisofthepublishednucleotidesequenceofORFVB2Lgene.TheB2Lgene'sspecificpairofprimersweredesigned.TheB2LgenewasamplifiedbyPCR,thenthephylogenetictreeisconstructed.TheB2Lgenewasabout1137bplong,itshared99%similaritieswiththereferencesequencewhichissubmitte
7、dtoNCBIGenBank,andithadhighhomologywiththeLiaoningstrain(HQ694773).ThentheB2LgenewasclonedintopET-32avector,pET-32a-B2Lrecombinantprokaryoticexpressionvectorwasconstructed,andwassuccessfμLlyexpressedinE.coli.BL21,TheproductwasdetectedbySDS-PAGEandWesternblot.PurifiedrecombinantB
8、2LproteinwasusedasanantigenforBALB/Cmicetomakep
