資源描述:
《豬輪狀病毒地方株的分離鑒定及其VP6基因的克隆與原核表達(dá)》由會(huì)員上傳分享,免費(fèi)在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫(kù)。
1、東北農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文豬輪狀病毒地方株的分離鑒定及其VP6基因的克隆與原核表達(dá)姓名:陳淑紅申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別:碩士專(zhuān)業(yè):預(yù)防獸醫(yī)學(xué)指導(dǎo)教師:李一經(jīng)2003.5.1摘要!!!自!!!!!!!自!!=§!!E!!!!!!#!!目$!!!g!!!目!!1511。要豬輪狀病毒(PorcineRotavi,rus,PRv)是呼腸孤病毒科輪狀病毒屬的成員,是引起仔豬病毒性腹瀉的主要病原之~,給世界各地的畜牧業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。我國(guó)PRV感染也非常普遍,有些地區(qū)斷奶仔豬陽(yáng)性率高達(dá)72%。本實(shí)驗(yàn)從吉林省某豬場(chǎng)發(fā)生腹瀉的豬群糞樣中,用M
2、Al04細(xì)胞培養(yǎng),分離到一株P(guān)RV,盲傳至4代出現(xiàn)明顯病變,經(jīng)電鏡觀察見(jiàn)有典型的車(chē)輪狀病毒顆粒。病毒核酸的聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)表明:其電泳型為4:2:3:2型,屬于A群輪狀病毒。這株病毒被命名為JL94。/采用雙層法用MAl04細(xì)胞進(jìn)行病毒蝕斑試驗(yàn),JL94能形成大多數(shù)直徑約lmm左右的蝕斑,大部分形狀不規(guī)則,少部分呈圓形,鏡下可見(jiàn)清晰的不著色區(qū),此區(qū)由碎裂的死細(xì)胞團(tuán)構(gòu)成。采集人及9種動(dòng)物的紅細(xì)胞,用病毒的細(xì)胞培養(yǎng)物做血凝和血凝抑制試驗(yàn),來(lái)檢測(cè)JL94的血凝特性。血凝試驗(yàn)證明JL94不凝集雞、鵝、猴、小白鼠
3、、豚鼠、山羊、狗、人的O型、A型及B型紅細(xì)胞。對(duì)于兔、豬的紅細(xì)胞集現(xiàn)象不穩(wěn)定,有待于進(jìn)~步確定。根據(jù)GenBank中的多株豬A群輪狀病毒VP6蛋白完整基因序列,利用oli9041設(shè)計(jì)引物,以JL94RNA為模板,通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增出長(zhǎng)約1.3kb的基因片段,命名為VP6。將其插入克隆載體質(zhì)粒pMDl8-T的EcoKV酶切位點(diǎn)處,構(gòu)建重組質(zhì)粒pMDl8.T—vP6。對(duì)克隆的VP6基因進(jìn)行序列測(cè)定,測(cè)序結(jié)果顯示JL94VP6基因全長(zhǎng)1356bp,含有完整的開(kāi)放閱讀框架,編碼397個(gè)氮基酸。將其VP6序列與豬A群輪狀病毒
4、代表株OSU(噩組I)、Gottfried(亞組II)的VP6進(jìn)行同源比較,結(jié)果顯示,核苷酸序列同源性分別為8685%、82.41%,氨基酸序列同源性分別為97.48%、93.20%,結(jié)果表明3-L94地方分離株與0SU株在基因型上更為接近。從重組質(zhì)粒pMDl8-T_一VP6上將VP6基因亞克隆到表達(dá)載體質(zhì)粒pET.30a,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),IPTG誘導(dǎo)以后表達(dá)出預(yù)計(jì)的45ku的融合蛋白,同時(shí)還有一些小的蛋白表達(dá)出來(lái),光密度掃描對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行初步定量表明,45ku融合蛋白占菌體總蛋白的26.5%。表達(dá)產(chǎn)
5、物經(jīng)Ni—NTA金屬螯合層析柱純化后,得到純化的His.taggedVP6融合蛋白。采用Western-blot對(duì)表達(dá)產(chǎn)物及純化產(chǎn)物進(jìn)行反應(yīng)原性分析,結(jié)果表明所得His-taggedVP6融合蛋白具有較好的抗原反應(yīng)特異性。之,pL一本研究為國(guó)內(nèi)PRV毒株鑒定、分子流行病學(xué)調(diào)查、分子診斷試劑的開(kāi)發(fā)以及基因工程疫苗的研制提供了理論依據(jù)和物質(zhì)基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞豬輪狀病毒;分離鑒定;VP6基因:克隆:原核表達(dá)、VIsolationandCharacterizationofPorcineRotavirusandItsVP6GeneC
6、loningandExpressioninEscherichiaColiAbstractPorcineRotavirus(PRV)belongstothefamilyreoviridae.Itisoneofthemajorpathogensofdiarrheainpigletsandcausesamajorhealthworldwideingraziery.InfectionofPRVisalsoprevalentinchina,insomeareatheinfectiousratioofpigletsis72%.A
7、ccuratediagnosisanderiectivevaccinationaremainmeansforthepreventionofPRVdiarrheaInthisstudy,porcinerotaviruswassuccessfullyisolatedfromdiarrhealpigletfecalsamplesfromJilinprovinceMA104cellswereusedforthereplicationandisolationofthevirus.Afterfourpassages,theiso
8、latecouldproduceobviouscytopahiceffects(CPE).Typicalrotavirusparticleswereseenwithdirectelectronmicroscope.Polyacrylamidegelelectrophoresis(PAGE)ofitsdsRNAgenomeshoweditsRNA