人參皂苷Rg1與CpG DNA佐劑對細胞免疫功能的影響

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1、華東區(qū)第十七次中獸醫(yī)科研協作與學術研討會論文匯編人參皂苷Rgl與CpGDNA佐劑對細胞免疫功能的影響許小琴1李jt-Jtl韋旭斌妒(1、櫥州太學2、古彝大學)摘要:為了探索人參皂苷R劫與菌體cpoDNA聯合作為重組質粒peDNA-VP2基因疫苗免疫佐劑提高免疫效果的作用機理,采用雞外周血淋巴細胞的體外誘導實驗,通過細胞形態(tài)學觀察、M兀測定法、流式細胞儀測定法和抗病毒性細胞病變抑制實驗等,分別觀察Rg.-CpG聯合免疫佐劑對雞外周血淋巴細胞的轉化、增殖、活性及誘生干擾素效價的影響。結果顯示:聯合免疫佐荊按Rgl25峙+CpG12.5pg/mL的添加量.能使PHA誘導的

2、淋巴細胞轉化率由74.3%顯著增加到93.5%;細胞增殖率由4.88%顯著增加到22.4%:抗VSV的干擾素效價由25顯著增加到29。表明Rgl-CpG聯合免疫佐劑具有明顯促進雞外周血淋巴細胞免疫功能的作用。關鍵詞:人參皂苷R91;CpGDNA;免疫佐劑:細胞免疫人參皂苷Rgl與菌體CpGDNA聯合作為重組質粒pcDNA-VP2基因疫苗的免疫佐劑,經動物免疫實驗證實,既能提高基因疫苗免疫的血清抗體效價,又能提高免疫雞抗超強毒攻擊的保護率(另文報道)?,F有的研究表明:人參皂苷R舶主要是促進血清中自蛋白、r.球蛋白、脾臟中蛋白質的合成,又通過促進巨噬細胞的吞噬能力、增加

3、抗原提呈,以提高抗原刺激機體產生抗體的效率”捌;cpoDNA是一種含胞嘧啶、鳥嘌呤二核苷酸(cpG)的DNA片段,主要是通過與細胞表面的一種核苷酸非特異性受體結合,直接激活B淋巴細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞,誘導他們分泌兒.6、IL-12和TNF-d、IFN-r等細胞因子,從而激活整個免疫系統oⅣ】。為了探索二者聯合應用提高重組質粒基因疫苗免疫效果的機理,本文采用雞外周血淋巴細胞誘導實驗,通過細胞形態(tài)學觀察、MTT測定法、流式細胞儀測定法和抗病毒性細胞病變抑制實驗等,分別觀察Rgl、CpG和R91.CpG對雞外周血淋巴細胞的轉化、增殖、活性以及誘導淋巴細胞產生干擾素效

4、價的影響。1材料與方法1.1材料35日齡SPF自來航雞、SPF雞種蛋,均購自中牧實業(yè)股分有限公司南京藥械廠SPF雞繁殖場。水泡性口炎病毒(VSV)由南京農業(yè)大學陳溥言教授惠贈;禽源高致病性大腸桿菌(037株),由揚州大學畜禽傳染病農業(yè)部重點開放實驗室分離鑒定。DMEM,RPMI1640為GibeoBRL公司產品;新生牛血清為杭州四季青公司產品。FITC標記的羊抗鼠IgG為Sigma公司產品;抗]BDV26E10單抗由美國禽病與腫瘤研究所患贈;雞r干擾索由本室制備。人參皂苷Rg-為香港國際貿易有限公司天然有機化合物信息中&,(OELTA公司)產品;PHA為上海伊華醫(yī)學

5、科技有限公司產品;淋巴細胞分離液為上海華精生物高科技有限公司產品;MTT為上海生物工程有限公司產品iDMSO為CxbioBioteehnology公司產品。PI(propidiumiodide,碘化丙啶)為Sigma公司產品。其它常規(guī)試劑均為國產分析純級產品。1.2C扣GDNA制各常規(guī)方法培養(yǎng)禽大腸桿菌(037株),按文獻(6】方法提取菌體DNA,經一20℃和37"(2反復凍融5次后,于使用前煮沸10rain,然后冰浴中冷卻30rain,制成2mg/mL溶液備用。109華東區(qū)第十七次中獸醫(yī)科研協作與學術研討會論文匯編1.3淋巴細胞轉化實驗1.3.1形態(tài)學觀察無菌采取

6、35日齡SPF白來航雞血液3ml,肝素鈉抗凝,加等量的RPMI1640培養(yǎng)液,輕輕顛倒混勻,用淋巴細胞分離液,經水平離心機1500r/rain離心15rain,分離淋巴細胞,用含5%小牛血清的1640生長液配制成5×106/mL個淋巴細胞懸液,裝瓶分組,每組重復5瓶。各組添加的藥物及其濃度分別是;第1組為PHA50ug+Rgl25ug/mL;第2組為PHA50119+cpGl2.5ug/mL;第3組為PHA50pg+R9125Itg+CpGl2.5Itg/mL;第4組為PHA50ug/mL;第5組為僅加生長液的空白對照組。分別加入各種免疫佐劑藥物后,于3TC、5%C

7、02培養(yǎng)箱中誘導培養(yǎng),每天輕輕搖動2次。經72h培養(yǎng)后,1500r/min離心15min,分別收取各組淋巴細胞培養(yǎng)上清.于一20"C保存?zhèn)溆?。將細胞沉淀物推片,瑞氏染色,每片觀察200個淋巴細胞,每組重復5次,統計并計算淋巴細胞轉化率。1.3.2流式細胞儀檢測分離雞外周血液淋巴細胞,用1640生長液調整細胞數為5X106/mL,按2Ⅱlu瓶,裝瓶分組,按每mL淋巴細胞懸液分別加入試驗藥物:A組:PHA50Itg+Rgj25Itg;B組:PHA50itg+Rgl25ug+Cp912.5I-tg;C組:PHA50ug;D組:為僅加生長液的空白對照。于37℃5%C02

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