人參皂苷Rg1與CpG DNA佐劑對(duì)細(xì)胞免疫功能的影響

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1、華東區(qū)第十七次中獸醫(yī)科研協(xié)作與學(xué)術(shù)研討會(huì)論文匯編人參皂苷Rgl與CpGDNA佐劑對(duì)細(xì)胞免疫功能的影響許小琴1李jt-Jtl韋旭斌妒(1、櫥州太學(xué)2、古彝大學(xué))摘要：為了探索人參皂苷R劫與菌體cpoDNA聯(lián)合作為重組質(zhì)粒peDNA-VP2基因疫苗免疫佐劑提高免疫效果的作用機(jī)理，采用雞外周血淋巴細(xì)胞的體外誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、M兀測(cè)定法、流式細(xì)胞儀測(cè)定法和抗病毒性細(xì)胞病變抑制實(shí)驗(yàn)等，分別觀察Rg．-CpG聯(lián)合免疫佐劑對(duì)雞外周血淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、增殖、活性及誘生干擾素效價(jià)的影響。結(jié)果顯示：聯(lián)合免疫佐荊按Rgl25峙+CpG12．5pg／mL的添加量．能使PHA誘導(dǎo)的

2、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率由74．3％顯著增加到93．5％；細(xì)胞增殖率由4．88％顯著增加到22．4％：抗VSV的干擾素效價(jià)由25顯著增加到29。表明Rgl-CpG聯(lián)合免疫佐劑具有明顯促進(jìn)雞外周血淋巴細(xì)胞免疫功能的作用。關(guān)鍵詞：人參皂苷R91；CpGDNA；免疫佐劑：細(xì)胞免疫人參皂苷Rgl與菌體CpGDNA聯(lián)合作為重組質(zhì)粒pcDNA-VP2基因疫苗的免疫佐劑，經(jīng)動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)證實(shí)，既能提高基因疫苗免疫的血清抗體效價(jià)，又能提高免疫雞抗超強(qiáng)毒攻擊的保護(hù)率(另文報(bào)道)。現(xiàn)有的研究表明：人參皂苷R舶主要是促進(jìn)血清中自蛋白、r．球蛋白、脾臟中蛋白質(zhì)的合成，又通過促進(jìn)巨噬細(xì)胞的吞噬能力、增加

3、抗原提呈，以提高抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體的效率”捌；cpoDNA是一種含胞嘧啶、鳥嘌呤二核苷酸(cpG)的DNA片段，主要是通過與細(xì)胞表面的一種核苷酸非特異性受體結(jié)合，直接激活B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞，誘導(dǎo)他們分泌兒．6、IL-12和TNF-d、IFN-r等細(xì)胞因子，從而激活整個(gè)免疫系統(tǒng)oⅣ】。為了探索二者聯(lián)合應(yīng)用提高重組質(zhì)?；蛞呙缑庖咝Ч臋C(jī)理，本文采用雞外周血淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、MTT測(cè)定法、流式細(xì)胞儀測(cè)定法和抗病毒性細(xì)胞病變抑制實(shí)驗(yàn)等，分別觀察Rgl、CpG和R91．CpG對(duì)雞外周血淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、增殖、活性以及誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞產(chǎn)生干擾素效

4、價(jià)的影響。1材料與方法1．1材料35日齡SPF自來航雞、SPF雞種蛋，均購自中牧實(shí)業(yè)股分有限公司南京藥械廠SPF雞繁殖場(chǎng)。水泡性口炎病毒(VSV)由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)陳溥言教授惠贈(zèng)；禽源高致病性大腸桿菌(037株)，由揚(yáng)州大學(xué)畜禽傳染病農(nóng)業(yè)部重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室分離鑒定。DMEM，RPMI1640為GibeoBRL公司產(chǎn)品；新生牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品。FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG為Sigma公司產(chǎn)品；抗]BDV26E10單抗由美國禽病與腫瘤研究所患贈(zèng)；雞r干擾索由本室制備。人參皂苷Rg-為香港國際貿(mào)易有限公司天然有機(jī)化合物信息中&,(OELTA公司)產(chǎn)品；PHA為上海伊華醫(yī)學(xué)

5、科技有限公司產(chǎn)品；淋巴細(xì)胞分離液為上海華精生物高科技有限公司產(chǎn)品；MTT為上海生物工程有限公司產(chǎn)品iDMSO為CxbioBioteehnology公司產(chǎn)品。PI(propidiumiodide，碘化丙啶)為Sigma公司產(chǎn)品。其它常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純級(jí)產(chǎn)品。1．2C扣GDNA制各常規(guī)方法培養(yǎng)禽大腸桿菌(037株)，按文獻(xiàn)(6】方法提取菌體DNA，經(jīng)一20℃和37"(2反復(fù)凍融5次后，于使用前煮沸10rain，然后冰浴中冷卻30rain，制成2mg／mL溶液備用。109華東區(qū)第十七次中獸醫(yī)科研協(xié)作與學(xué)術(shù)研討會(huì)論文匯編1．3淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)1．3．1形態(tài)學(xué)觀察無菌采取

6、35日齡SPF白來航雞血液3ml，肝素鈉抗凝，加等量的RPMI1640培養(yǎng)液，輕輕顛倒混勻，用淋巴細(xì)胞分離液，經(jīng)水平離心機(jī)1500r／rain離心15rain，分離淋巴細(xì)胞，用含5％小牛血清的1640生長液配制成5×106／mL個(gè)淋巴細(xì)胞懸液，裝瓶分組，每組重復(fù)5瓶。各組添加的藥物及其濃度分別是；第1組為PHA50ug+Rgl25ug／mL；第2組為PHA50119+cpGl2．5ug／mL；第3組為PHA50pg+R9125Itg+CpGl2．5Itg／mL；第4組為PHA50ug／mL；第5組為僅加生長液的空白對(duì)照組。分別加入各種免疫佐劑藥物后，于3TC、5％C

7、02培養(yǎng)箱中誘導(dǎo)培養(yǎng)，每天輕輕搖動(dòng)2次。經(jīng)72h培養(yǎng)后，1500r／min離心15min，分別收取各組淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清．于一20"C保存?zhèn)溆?。將?xì)胞沉淀物推片，瑞氏染色，每片觀察200個(gè)淋巴細(xì)胞，每組重復(fù)5次，統(tǒng)計(jì)并計(jì)算淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率。1．3．2流式細(xì)胞儀檢測(cè)分離雞外周血液淋巴細(xì)胞，用1640生長液調(diào)整細(xì)胞數(shù)為5X106／mL，按2Ⅱlu瓶，裝瓶分組，按每mL淋巴細(xì)胞懸液分別加入試驗(yàn)藥物：A組：PHA50Itg+Rgj25Itg；B組：PHA50itg+Rgl25ug+Cp912．5I-tg；C組：PHA50ug；D組：為僅加生長液的空白對(duì)照。于37℃5％C02