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《凡納濱對蝦G 蛋白G q 基因的克隆和功能鑒定》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、凡納濱對蝦G蛋白Gq基因的克隆和功能鑒定11,211,31葉志云,金利華,鄒海鷹,駱晶晶,林圣彩(1.廈門大學生命科學學院,福建廈門361005;2.廈門大學材料學院生物醫(yī)學工程研究中心,福建廈門361005;3.加拿大阿爾伯特卡爾加里大學生物化學與分子生物學系,加拿大)摘要:為了尋找并克隆凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)G蛋白亞基,為研究對蝦的生理調(diào)控提供理論基礎(chǔ),通過簡并PCR和RACE反應(yīng)獲得目的基因的全長cDNA序列;用Blast,DNAstar和Genedoc軟件對所得序列進行分析,確定所得序列為凡納濱對蝦
2、G蛋白Gq基因,命名為pvGq。將該基因的編碼序列克隆到表達載體,通過免疫共沉淀實驗和胞內(nèi)Ca2+,IP3濃度的測定鑒定該Gq亞基的功能,發(fā)現(xiàn)該亞基的序列和功能與其他Gq家族成員具有高度保守性。用Westernblotting分析發(fā)現(xiàn)pvGq在對蝦身體各部位存在普遍分布,尤其在腦神經(jīng)、眼柄、腮和顎片中有大量表達,在嗅覺器官觸角也有適量分布。說明了pvGq在對蝦生命活動中的重要性,為研究對蝦的生理調(diào)控奠定了理論基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞:G蛋白;克隆;凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)中圖分類號:Q78文獻標識碼:A
3、文章編號:10003096(2008)08006406凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)是世界養(yǎng)列設(shè)計一對簡并引物,正向引物序列為5AGCACI殖產(chǎn)量最高的三大蝦種之一。該品種原產(chǎn)于美洲太(AT)T(ACT)(AG)TIAA(AG)CA(AG)ATG3,平洋沿岸水域。自1988年引入我國后,國內(nèi)科學工反向引物序列為5TTGAA(AG)CA(AGCT)TG作者就它的生活習性、育苗、養(yǎng)殖、抗病等方面做了(AGT)ATCCA(CT)TT3。引物由上海生工生物大量研究。但是從分子生物學的角度去研
4、究凡納濱工程服務(wù)有限公司合成。25L簡并PCR反應(yīng)體系對蝦的生長、發(fā)育等調(diào)控機制的報道還很少見。如下:上述第一鏈cDNA1.5L,10mol/L的兩向很多實驗表明,G蛋白在無脊椎動物(包括美國簡并引物各2L,10mmol/L的dNTP0.6L,Taq龍蝦Homarusamericanus)的嗅覺和視覺信號途徑DNA聚合酶(寶生物工程(大連)有限公司)[1~3]中起著極其重要的作用。而氣味、光線、食物等1.25U,10緩沖液2.5L,超純水16.2L。PCR因素在對蝦等低等生物的生活習性中都是很重要的擴增程序為:94!變性3mi
5、n;94!變性30s,42!退因素。因此,作者主要尋找并克隆對蝦G蛋白信號火60s,72!延伸60s,循環(huán)40次;最后72!延伸途徑中的功能基因G蛋白亞基,并就該亞基的結(jié)3min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,回收目的片段構(gòu)和功能進行分析,旨在為對蝦的生長、發(fā)育、抗病DNA并克隆到pBluescriptSK()載體,由上海生工及養(yǎng)殖等生理調(diào)控提供一定的理論基礎(chǔ)。測序。1材料和方法1.3快速擴增cDNA末端反應(yīng)1.1總RNA的提取和cDNA的合成快速擴增cDNA末端反應(yīng)(RapidAmplificationofcDNAEnds,RAC
6、E)。上述克隆的測序結(jié)果通過體長8cm左右的凡納濱對蝦購自廈門大學白NCBI網(wǎng)站Blastx軟件比對,初步確定為目的基因城菜市場。將活體對蝦的腦神經(jīng)迅速取出,用后,根據(jù)片段序列設(shè)計兩條特異引物分別進行5端和RNeasyminikit試劑盒(美國Qiagen公司)提取總3端RACE反應(yīng)。進行5端RACE反應(yīng)的引物序列RNA,操作過程見試劑盒說明書。RNA經(jīng)1.0%瓊為5CTCATAGTCCACCGCTCGCACCAGAT3,進脂糖凝膠電泳,溴化乙啶染色鑒定,260nm處測定RNA吸光度。取總RNA2g,用SMARTRACEcD
7、NAAmplificationKit試劑盒(美國Clontech公收稿日期:20050927;修回日期:20080515司)合成第一鏈cDNA。操作過程見說明書?；痦椖?國家863計劃資助項目(2002AA629060)1.2簡并PCR作者簡介:葉志云(1962),女,廣西南寧人,高級工程師,學士,主要從根據(jù)已知其他物種G蛋白亞基的高度保守序事生物化學研究,電話:05922182993,Email:yzy1893@xmu.edu.cn64海洋科學/2008年/第32卷/第8期行3端RACE反應(yīng)的引物序列為5ATGA
8、T30min。再用HEPES緩沖液(HEPES10mmol/L,CAGGGCCATGGACCTTCTTCAA3。RACE反Na2HPO41mmol/L,NaCl137mmo
