王春瓊開題報(bào)告

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1、畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）開題報(bào)告題目：馬尾松林土壤中纖維素分解菌的篩選及酶活力探究姓名：王春瓊學(xué)號(hào)：08110801036教學(xué)院：地理與生命科學(xué)學(xué)院專業(yè)班級(jí)：生物科學(xué)2008級(jí)指導(dǎo)教師：游萍(講師)畢節(jié)學(xué)院教務(wù)處制4一、選題依據(jù)（包括選擇課題的背景、選題研究的理論及實(shí)踐意義）纖維素是自然界中最廉價(jià)、最豐富的可再生資源,纖維素的利用與轉(zhuǎn)化對(duì)于解決能源危機(jī)、糧食短缺、環(huán)境污染等問題具有十分重要的意義。迄今為止，國內(nèi)外已有大量關(guān)于纖維素酶生產(chǎn)菌株的研究報(bào)導(dǎo)，其中研究較多的是真菌中的木霉和細(xì)菌中的熱纖梭菌。許多研究者從堆肥、造紙廠、動(dòng)物瘤胃、森林土壤等環(huán)境中篩選高產(chǎn)纖維素酶菌[1]，而松樹環(huán)境中篩選的研

2、究未見報(bào)道。剛果紅可以與纖維素形成紅色復(fù)合物，當(dāng)纖維素被纖維素酶分解后，紅色復(fù)合物無法形成，出現(xiàn)以纖維素分解菌為中心的透明圈，我們可以通過是否產(chǎn)生透明圈來篩選纖維素分解菌。產(chǎn)酶越多，水解圈越大，產(chǎn)酶越快，水解圈出現(xiàn)越早。纖維素酶能將底物（濾紙、羧甲基纖維素鈉）水解，產(chǎn)生還原糖，利用DNS試劑測(cè)定產(chǎn)生的還原糖，從而計(jì)算出纖維素分解菌酶活力（濾紙酶活力、羧甲基纖維素酶活力和濾紙崩潰時(shí)間）。濾紙酶活力通常代表纖維素分解菌酶的總活力。纖維素分解菌與土壤中其他生理類群之間存在著相互作用。由植物殘?bào)w帶入土壤的纖維素能在纖維素分解菌或其產(chǎn)生的酶作用下將其分解成簡單的物質(zhì),可以作為自生固氮菌的碳源,增加

3、土壤中自生固氮菌和纖維素分解菌的數(shù)量,提高土壤的肥力和熟化程度[2]。纖維素分解菌直接參與土壤碳、氮等營養(yǎng)元素的循環(huán)和能量流動(dòng),其數(shù)量和活性直接關(guān)系土壤生態(tài)系統(tǒng)的維持和改善。并且,纖維素分解菌是土壤有機(jī)殘?bào)w分解的中心環(huán)節(jié),其分解強(qiáng)度反映了土壤微生物對(duì)有機(jī)殘?bào)w分解的程度和速度,直接關(guān)系到土壤有機(jī)質(zhì)的形成與積累[3]。它們的分布與土壤的性狀、土壤的肥力有著密切的關(guān)系[4]。纖維素酶的研究、開發(fā)、利用,對(duì)解決工農(nóng)業(yè)原料來源、能源危機(jī)、環(huán)境污染等問題具有十分重要的意義。二、選題研究現(xiàn)狀（包括目前國內(nèi)外對(duì)本選題的研究情況和有待解決的問題）目前國內(nèi)外對(duì)本選題的研究情況：目前研究較多的是霉菌,其中木霉

4、、曲霉、根霉和青霉均具有較強(qiáng)的酶活力,尤以綠色木霉、里氏木霉和康氏木霉為典型[5-6]；在生物能源方面,以植物纖維為原料生產(chǎn)燃料乙醇能節(jié)約大量淀粉資源,降低燃料乙醇的成本[7]。降解纖維素的微生物種類很多,研究較多的是木霉屬、曲霉屬、青霉屬、根霉屬和漆斑霉屬。迄今為止，國內(nèi)外已有大量關(guān)于纖維素酶生產(chǎn)菌株的研究報(bào)導(dǎo)，其中研究較多的是真菌中的木霉和細(xì)菌中的熱纖梭菌，許多研究者從堆肥、造紙廠、動(dòng)物瘤胃、森林土壤等環(huán)境中篩選高產(chǎn)纖維素酶菌株。有待解決的問題：搖床轉(zhuǎn)速對(duì)產(chǎn)酶酶活的影響；金屬離子對(duì)產(chǎn)酶酶活的影響。4三、研究內(nèi)容與方法儀器：分光光度計(jì)、恒溫水浴鍋、搖床、秒表、精密PH試紙、試管、燒杯、

5、移液管、濾紙、錐形瓶、離心機(jī)等。試劑：磷酸氫二鈉、檸檬酸、羧甲基纖維素鈉、3,5-二硝基水楊酸、氫氧化鈉、石酸鉀鈉、亞硫酸鈉、苯酚、醋酸鈉、冰醋酸等。分解菌的分離[8]取樣品1g置于裝有100ml無菌水的燒杯中，搖勻，靜止15min，然后稀釋成10-2―10-5各濃度的稀釋液，各取0.1ml稀釋液分別涂布到三個(gè)初篩分離培養(yǎng)基上。倒置恒溫28℃培養(yǎng)6―7d。分解菌的初篩[9]挑取單一菌落劃線培養(yǎng)到初篩分離平板上，經(jīng)過多次劃線分離純化。分解菌的復(fù)篩[10-12]用接種環(huán)取一環(huán)纖維素分解菌純培養(yǎng)物點(diǎn)種到復(fù)篩平板上，每株菌分別點(diǎn)兩個(gè)平板，每個(gè)皿中點(diǎn)三個(gè)樣。倒置恒溫28℃培養(yǎng)3d。然后選取水解圈最

6、大的幾株纖維素分解菌點(diǎn)種到試管斜面培養(yǎng)基上，恒溫28℃培養(yǎng)3d。制備粗酶液[13]取3ml無菌水將復(fù)篩所獲得的分解菌斜面培養(yǎng)物制成菌懸液，然后過濾，取0.3ml濾液接入裝有50ml液體培養(yǎng)基的150ml三角瓶中，在150r∕min搖床上振蕩培養(yǎng)，于28℃培養(yǎng)48h。所得發(fā)酵液經(jīng)4000r/min離心15min,上清液即為粗酶液。酶活力測(cè)定纖維素酶的測(cè)定采用DNS還原糖法。繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線、3,5-二硝基水楊酸(DNS)顯色試劑的配制、檸檬酸緩沖液和CMC溶液的配制。測(cè)定濾紙酶活力[14]、濾紙崩潰程度[15]和CMC酶活力[16-17]。初始PH對(duì)酶的相對(duì)比活力的影響[18]配置PH3

7、.0—9.0的復(fù)篩培養(yǎng)基，各梯度分別點(diǎn)種3個(gè)平板，每個(gè)皿點(diǎn)3個(gè)樣，倒置恒溫28℃培養(yǎng)5d后測(cè)酶的相對(duì)比活力：A=水解圈直徑／天數(shù)。4四、研究的主客觀條件研究的主觀條件：現(xiàn)階段本科生還不具有相應(yīng)的研究能力，需要慢慢的摸索比較耗時(shí)，研究的方向性不強(qiáng)；已具備相應(yīng)的微生物學(xué)基礎(chǔ)知識(shí)，具備一定的實(shí)驗(yàn)操作能力與技巧；我小組人員具有嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)態(tài)度，職業(yè)道德素養(yǎng)，具備敬業(yè)精神；應(yīng)用的方法具有局限性。研究的客觀條件：有指導(dǎo)教師進(jìn)行指導(dǎo)；微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室