《核酸電泳》PPT課件

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1、核酸物質(zhì)提取與電泳天然DNA的制備一般地說?？侱NA主要是指基因組DNA(genomicDNA)，即細(xì)胞核內(nèi)的染色體DNA分子。核DNA分子呈極不對稱的線狀結(jié)構(gòu)．一條染色體為一個(gè)DNA分子。高等植物核DNA大約含有106bp,其長度與直徑的比例極不對稱．使其對機(jī)械力十分敏感。雖然目前可以成功地測定出它的一級結(jié)構(gòu)。但仍難以分離出它的完整分子。1.天然DNA的來源(1)染色體DNA(2)病毒與噬菌體(3)質(zhì)粒DNA(4)線粒體與葉綠體2.DNA的提取細(xì)胞的破碎破碎的手段：物理方式：超聲波法、勻漿法、液氮破碎法:容易導(dǎo)致DNA

2、鏈的斷裂.對于細(xì)胞破碎較困難的植物材料，可以輔加蛋白酶K，在酶的存在下共同破碎細(xì)胞。超生波液氮總DNA的提取方法：去除多糖、脂類、蛋白等，得到的就是核酸去除多糖：CTAB、PVP、高鹽溶液等去除脂類：SDS、CTAB等去除蛋白：SDS、蛋白酶Ｋ、酚／氯仿等DNARNA質(zhì)粒DNA的提取破壞細(xì)胞壁溶菌酶、強(qiáng)堿和十二烷基磺酸鈉(SDS)裂解細(xì)胞膜十二烷基磺酸鈉(SDS)、TritonX-100蛋白質(zhì)及其它雜質(zhì)的去除SDS使蛋白形成不溶物，沉淀出來高濃度鹽離子(KCl)使變性蛋白、多糖、細(xì)胞碎屑等沉淀出來細(xì)菌線形染色體DNA的去

3、除強(qiáng)熱、堿處理時(shí)，細(xì)菌線性染色體DNA變性，當(dāng)快速降溫、加入酸中和時(shí)，已變性的細(xì)菌線性染色體DNA變性不能快速復(fù)性，與其它雜質(zhì)纏繞而沉淀出來質(zhì)粒DNA雙鏈可快速恢復(fù)原狀,重新形成超螺旋分子,并以溶解狀態(tài)存在于液相中。3.DNA的濃縮(1)乙醇(2)異丙醇(3)聚乙二醇(PEG600)工作區(qū)域應(yīng)與進(jìn)行普通微生物實(shí)驗(yàn)的區(qū)域分離好RNA的提取分離RNA提取的通用方法異硫氰酸胍/苯酚法原理：細(xì)胞在變性劑異硫氰酸胍的作用下被裂解，同時(shí)核蛋白體上的蛋白變性，核酸釋放；釋放出來的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分別位于整個(gè)

4、體系中的中間相和水相，從而得以分離；有機(jī)溶劑抽提，沉淀，得到純凈RNA。異硫氰酸胍/苯酚法步驟:材料準(zhǔn)備：盡量新鮮。裂解變性：異硫氰酸胍（亞硫氫胍，巰基乙醇，N-月桂肌氨酸等）。使細(xì)胞及核蛋白復(fù)合物變性，釋放RNA，有效抑制核酸酶。純化分離：苯酚，氯仿，異戊醇。苯酚/氯仿可抽提去除雜物。洗滌：70％乙醇。沉淀：異丙醇、無水乙醇。乙酸鈉（pH4.0）：維持變性的細(xì)胞裂解液的pH值，沉淀RNA。此外還常用氯化鋰選擇沉淀RNA。RNA提取的通用方法影響RNA提取的因素材料：新鮮，切忌使用反復(fù)凍融的材料如若材料來源困難，且實(shí)驗(yàn)需

5、要一定的時(shí)間間隔?？梢韵葘⒉牧腺A存在TRIzol或樣品貯存液中，于－70℃或－20℃保存如要多次提取，請分成多份保存液氮長期保存，－70℃短期保存影響RNA提取的因素樣品破碎及裂解：根據(jù)不同材料選擇不同的處理方法：培養(yǎng)細(xì)胞：通?？芍苯蛹恿呀庖毫呀饨湍负图?xì)菌：一般TRIzol可直接裂解，對于一些特殊的材料可先用酶或者機(jī)械方法破壁動(dòng)植物組織：先液氮研磨和勻漿，后加裂解液裂解。期間動(dòng)作快速，樣品保持冷凍樣品量適當(dāng)，保證充分裂解為減少DNA污染，可適當(dāng)加大裂解液的用量純化：在使用氯仿抽提純化時(shí)，一定要充分混勻，且動(dòng)作快速；經(jīng)典的

6、純化方法，如LiCl沉淀等，雖然經(jīng)濟(jì)，但操作時(shí)間長，易造成RNA降解；柱離心式純化方法：抽提速度快，能有效去除影響RNA后續(xù)酶反應(yīng)的雜質(zhì)，是目前較為理想的選擇。影響RNA提取的因素RNA提取常見問題RNA的降解OD260/OD280比值偏低電泳帶型異常下游實(shí)驗(yàn)效果不佳RNA降解新鮮細(xì)胞或組織：裂解液的質(zhì)量外源RNase的污染裂解液的用量不足組織裂解不充分另外某些富含內(nèi)源酶的樣品(如脾臟，胸腺等)，很難避免RNA的降解。建議在液氮條件下將組織碾碎，并且勻漿時(shí)使用更多裂解液。RNA降解冷凍樣品：樣品取材后應(yīng)立即置于液氮中速凍

7、，然后可以移至-70℃冰箱保存。樣品要相對小一點(diǎn)；先用液氮研磨，再加裂解液勻漿；樣品與裂解液充分接觸前避免融化，研磨用具必須預(yù)冷，碾磨過程中及時(shí)補(bǔ)充液氮。OD260/OD280比值偏低蛋白質(zhì)污染：不要吸入中間層及有機(jī)相，加入氯仿后首先混勻，并且離心分層的離心力和時(shí)間要足夠。減少起始樣品量，確保裂解完全、徹底解決辦法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。苯酚殘留：不要吸入中間層及有機(jī)相，加入氯仿后首先混勻，并且離心分層的離心力和時(shí)間要足夠。解決辦法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。OD260/OD280比值偏低抽提試劑殘留：確保洗滌時(shí)

8、要徹底懸浮RNA，并且徹底去掉75%乙醇。解決辦法:再沉淀一次后，溶解。設(shè)備限制：測定OD260及OD280數(shù)值時(shí)，要使OD260讀數(shù)在0.10-0.50之間。此范圍線性最好。用水稀釋樣品：測OD時(shí)，對照及樣品稀釋液請使用10mMTris，pH7.5。用水作為稀釋液將導(dǎo)致比值的降低。電泳帶型異常非變性電泳：上樣量超過