資源描述:
《原位雜交與凋亡檢測(cè)技術(shù)》由會(huì)員上傳分享,免費(fèi)在線(xiàn)閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫(kù)。
1、原位分子雜交技術(shù)原位雜交(insituhybridization,ISH)是應(yīng)用已知堿基順序并帶有標(biāo)記的核酸探針與組織、細(xì)胞中的待測(cè)的核酸按堿基配對(duì)的原則進(jìn)行特異的結(jié)合而形成雜交體。再應(yīng)用與標(biāo)記物相應(yīng)的檢測(cè)系統(tǒng),通過(guò)組織化學(xué)或免疫組織化學(xué)方法在被檢測(cè)的核酸原位形成帶有顏色的雜交信號(hào),在顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位。DNA---DNA;RNA---DNA;RNA---RNA人工合成寡核苷酸---DNA(RNA)常用方法:膜上雜交:用醋酸纖維膜和尼龍膜等作為載體,將靶基因轉(zhuǎn)移到膜上,然后用探針進(jìn)行雜交,陽(yáng)性結(jié)
2、果顯示為條紋或斑點(diǎn)。液相雜交:以生物素或丫啶翁酯標(biāo)記探針在溶液中用羥基磷灰石層析或吸附、親和吸附、磁珠吸附等方法進(jìn)行雜交,結(jié)果于計(jì)數(shù)器,光度計(jì)或用化學(xué)發(fā)光測(cè)定。原位雜交:在具有明確的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上,如一個(gè)細(xì)菌,一條染色體,細(xì)胞或組織上進(jìn)行核酸雜交,可以檢測(cè)到特定基因的準(zhǔn)確定位。原位雜交技術(shù)的出現(xiàn)是組織化學(xué)和免疫組織化學(xué)的革命性突破。一、原位雜交的分子生物學(xué)基礎(chǔ):(一)核酸的分子結(jié)構(gòu):C、H、O、N、P*核酸→水解→多聚核苷酸→水解→核苷、磷酸→水解→戊糖、含氮堿(堿基)、磷酸。(二)核酸的一級(jí)機(jī)構(gòu):堿基
3、共同成分:腺嘌呤(A),鳥(niǎo)嘌呤(G),胞嘧啶(C);區(qū)別:DNA含有胸腺嘧啶(T);RNA含有尿嘧啶(U)。(三)核酸的高級(jí)結(jié)構(gòu):根據(jù)堿基配對(duì)規(guī)律DNA:多核苷酸鏈可形成雙螺旋三、四股螺旋;但有高溫變性,低溫復(fù)性的特點(diǎn)。RNA:多核苷酸鏈一般以單鏈存在,僅有時(shí)局部形成小雙螺旋結(jié)構(gòu)。二、原位雜交的發(fā)展史:1、1969年美國(guó)耶魯大學(xué)Gall和Pardue首創(chuàng)用爪蟾核糖體基因探針與卵母細(xì)胞雜交,雜交點(diǎn)定位于核仁。同年,Buongiorno-Nardelli等用同位素標(biāo)記核酸探針對(duì)細(xì)胞和組織進(jìn)行定位。2、1
4、970年Orth用3H標(biāo)記兔乳頭狀瘤病毒cRNA探針在冰凍切片進(jìn)行雜交,首次用原位雜交技術(shù)檢出細(xì)胞中的病毒DNA。3、1981年Bauman應(yīng)用熒光素標(biāo)記cRNA探針,在熒光顯微鏡觀察成功。4、1983年Brigat首建生物素標(biāo)記的探針在組織切片上檢出病毒DNA.5、1987年Biochemisca推出地高辛標(biāo)記的試劑及藥盒。三、核酸探針的分類(lèi):按標(biāo)記方法分:1、放射性探針:用放射性同位素32P、35S、3H標(biāo)記,通過(guò)放射自顯影方法顯示。特點(diǎn):靈敏度高,輻射危害,耗時(shí)久,半衰期限制。2、非放射性探針
5、:用FITC,Biotin,DIG,HRP,AP標(biāo)記,用相應(yīng)的檢測(cè)系統(tǒng)顯示。特點(diǎn):靈敏度也高,安全,快速,廣泛應(yīng)用。按探針的性質(zhì)分:1、DNA探針:雙鏈:采用PCR方法,從基因庫(kù)釣取或人工合成。單鏈:將DNA片段裝載到質(zhì)?;蚓w中,以此為模板用Taq酶合成互補(bǔ)單DNA探針或以RNA為模板,用反轉(zhuǎn)錄酶合成單鏈cDNA探針。特點(diǎn):雙鏈長(zhǎng)度較長(zhǎng)(數(shù)百~數(shù)千個(gè)鹼基),信號(hào)強(qiáng),但滲透性差。單鏈較好。2、RNA探針:一般為單鏈;采用體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)(單向或雙向),用新型載體pSP和pGEM,在SP6RNA或T7RN
6、A聚合酶作用下進(jìn)行RNA轉(zhuǎn)錄而成。特點(diǎn):長(zhǎng)度隨意,穩(wěn)定,信號(hào)更強(qiáng)。3、寡核苷酸探針:已知基因序列,由核酸合成儀合成。特點(diǎn):鏈短,雜交速度快,特異性強(qiáng),價(jià)廉質(zhì)穩(wěn)。四、原位雜交技術(shù)的應(yīng)用:1、基因芯片(基因組圖);2、基因表達(dá)定位;3、轉(zhuǎn)基因檢測(cè)。4、核DNA和RNA的mRNA的排列和運(yùn)輸,復(fù)制和細(xì)胞分類(lèi)5、細(xì)胞遺傳學(xué)、產(chǎn)前診斷、腫瘤診斷6、病毒學(xué)和病原學(xué)、傳染性疾病的診斷7、生物學(xué)劑量的測(cè)定五、原位雜交技術(shù)的基本方法:包括:1、雜交前準(zhǔn)備:固定、取材、玻片和組織處理,增強(qiáng)核酸探針的穿透性,減低背景染色
7、等。2、雜交:3、雜交后處理:4、顯示:放射自顯影,組化或免疫組化顯色。(一)固定:DNA較穩(wěn)定,mRNA次之,RNA最易被酶降解。固定液:(1)4%的多聚甲醛(加1/1000DEPC)(2)冰醋酸酒精(3)Bouin固定劑(4)冰凍切片直接在(1)液10min(二)玻片處理:載玻片經(jīng)熱肥皂水刷洗---清潔液浸泡24h----95%酒精浸泡24h---蒸餾水沖洗----1500C以上烘箱過(guò)夜。玻片粘附劑:多聚賴(lài)氨酸,APES。蓋玻片應(yīng)做硅化處理。(三)防止RNA酶污染:1、整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程均需戴消毒手套
8、。2、實(shí)驗(yàn)用玻璃器皿在實(shí)驗(yàn)前一日置高溫(2400C)烘烤,以破壞RNA酶。(四)、增強(qiáng)組織的通透性和核酸探針的穿透性:1、TritonX-1002、蛋白酶K(ProteinaseK1ug/ml)370C15~20min3、胃蛋白酶(Pepsin20~100ug/ml)370C30min上述酶消化后用4%多聚甲醛后固定。(五)減低背景染色1、乙酸酐和三乙醇胺浸洗,以減低靜電效應(yīng)。2、雜交后酶處理。3、雜交后洗滌。(六)預(yù)雜交:用不含探針和硫酸葡聚糖的液體封閉非特異性雜交