原位雜交與凋亡檢測技術

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1、原位分子雜交技術原位雜交(insituhybridization,ISH)是應用已知堿基順序并帶有標記的核酸探針與組織、細胞中的待測的核酸按堿基配對的原則進行特異的結合而形成雜交體。再應用與標記物相應的檢測系統(tǒng)，通過組織化學或免疫組織化學方法在被檢測的核酸原位形成帶有顏色的雜交信號，在顯微鏡下進行細胞內(nèi)定位。DNA---DNA;RNA---DNA;RNA---RNA人工合成寡核苷酸---DNA(RNA)常用方法：膜上雜交：用醋酸纖維膜和尼龍膜等作為載體，將靶基因轉移到膜上，然后用探針進行雜交，陽性結

2、果顯示為條紋或斑點。液相雜交：以生物素或丫啶翁酯標記探針在溶液中用羥基磷灰石層析或吸附、親和吸附、磁珠吸附等方法進行雜交，結果于計數(shù)器，光度計或用化學發(fā)光測定。原位雜交：在具有明確的結構基礎上，如一個細菌，一條染色體，細胞或組織上進行核酸雜交，可以檢測到特定基因的準確定位。原位雜交技術的出現(xiàn)是組織化學和免疫組織化學的革命性突破。一、原位雜交的分子生物學基礎：（一）核酸的分子結構：C、H、O、N、P*核酸→水解→多聚核苷酸→水解→核苷、磷酸→水解→戊糖、含氮堿（堿基）、磷酸。（二）核酸的一級機構：堿基

3、共同成分：腺嘌呤(A)，鳥嘌呤(G)，胞嘧啶(C)；區(qū)別：DNA含有胸腺嘧啶(T)；RNA含有尿嘧啶(U)。（三）核酸的高級結構：根據(jù)堿基配對規(guī)律DNA：多核苷酸鏈可形成雙螺旋三、四股螺旋；但有高溫變性，低溫復性的特點。RNA：多核苷酸鏈一般以單鏈存在，僅有時局部形成小雙螺旋結構。二、原位雜交的發(fā)展史：1、1969年美國耶魯大學Gall和Pardue首創(chuàng)用爪蟾核糖體基因探針與卵母細胞雜交，雜交點定位于核仁。同年，Buongiorno-Nardelli等用同位素標記核酸探針對細胞和組織進行定位。2、1

4、970年Orth用3H標記兔乳頭狀瘤病毒cRNA探針在冰凍切片進行雜交，首次用原位雜交技術檢出細胞中的病毒DNA。3、1981年Bauman應用熒光素標記cRNA探針，在熒光顯微鏡觀察成功。4、1983年Brigat首建生物素標記的探針在組織切片上檢出病毒DNA.5、1987年Biochemisca推出地高辛標記的試劑及藥盒。三、核酸探針的分類：按標記方法分：1、放射性探針：用放射性同位素32P、35S、3H標記，通過放射自顯影方法顯示。特點：靈敏度高，輻射危害，耗時久，半衰期限制。2、非放射性探針

5、：用FITC,Biotin,DIG,HRP,AP標記，用相應的檢測系統(tǒng)顯示。特點：靈敏度也高，安全，快速，廣泛應用。按探針的性質(zhì)分：1、DNA探針：雙鏈：采用PCR方法，從基因庫釣取或人工合成。單鏈：將DNA片段裝載到質(zhì)粒或菌體中，以此為模板用Taq酶合成互補單DNA探針或以RNA為模板，用反轉錄酶合成單鏈cDNA探針。特點：雙鏈長度較長（數(shù)百~數(shù)千個鹼基），信號強，但滲透性差。單鏈較好。2、RNA探針：一般為單鏈；采用體外轉錄技術（單向或雙向），用新型載體pSP和pGEM，在SP6RNA或T7RN

6、A聚合酶作用下進行RNA轉錄而成。特點：長度隨意，穩(wěn)定，信號更強。3、寡核苷酸探針：已知基因序列，由核酸合成儀合成。特點：鏈短，雜交速度快，特異性強，價廉質(zhì)穩(wěn)。四、原位雜交技術的應用：1、基因芯片（基因組圖）；2、基因表達定位；3、轉基因檢測。4、核DNA和RNA的mRNA的排列和運輸，復制和細胞分類5、細胞遺傳學、產(chǎn)前診斷、腫瘤診斷6、病毒學和病原學、傳染性疾病的診斷7、生物學劑量的測定五、原位雜交技術的基本方法：包括：1、雜交前準備：固定、取材、玻片和組織處理，增強核酸探針的穿透性，減低背景染色

7、等。2、雜交：3、雜交后處理：4、顯示：放射自顯影，組化或免疫組化顯色。（一）固定：DNA較穩(wěn)定，mRNA次之，RNA最易被酶降解。固定液：(1)4%的多聚甲醛（加1/1000DEPC）(2)冰醋酸酒精(3)Bouin固定劑(4)冰凍切片直接在(1)液10min（二）玻片處理：載玻片經(jīng)熱肥皂水刷洗---清潔液浸泡24h----95%酒精浸泡24h---蒸餾水沖洗----1500C以上烘箱過夜。玻片粘附劑：多聚賴氨酸，APES。蓋玻片應做硅化處理。（三）防止RNA酶污染：1、整個實驗過程均需戴消毒手套

8、。2、實驗用玻璃器皿在實驗前一日置高溫（2400C）烘烤，以破壞RNA酶。（四）、增強組織的通透性和核酸探針的穿透性：1、TritonX-1002、蛋白酶K（ProteinaseK1ug/ml）370C15~20min3、胃蛋白酶（Pepsin20~100ug/ml）370C30min上述酶消化后用4%多聚甲醛后固定。（五）減低背景染色1、乙酸酐和三乙醇胺浸洗，以減低靜電效應。2、雜交后酶處理。3、雜交后洗滌。（六）預雜交：用不含探針和硫酸葡聚糖的液體封閉非特異性雜交