gd基因的克隆與表達(dá)

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1、萬(wàn)方數(shù)據(jù)巾國(guó)動(dòng)物檢疫2006年第23卷第7期t欄目主持人：胡藕祥文章編號(hào)：1005—944x(2006)07一0027-03牛傳染性鼻氣管炎病毒gD基因的克隆與表達(dá)曲光剛1-≈單虎1)★張志4李曉成妒郭麗鼴日f(shuō)1山東萊陽(yáng)農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院青島2652192．中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心青島2660323．揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院揚(yáng)州2250091摘要：構(gòu)建pET32a重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化到BL21∞E3)，誘導(dǎo)表迭牛傳染性鼻氣管炎病毒重組gD蛋白。用已發(fā)表的IBRv的—)基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，通過(guò)PcR方法擴(kuò)增一條766bp的目的基

2、因gD，將gD基因克隆到原核表達(dá)載體pet32a，得到重組表達(dá)載體pet32一gD，轉(zhuǎn)化到BL21(DE)中，通過(guò)IPTG誘導(dǎo)獲得融合蛋白。重組表達(dá)蛋白經(jīng)純化后，免疫印跡分析。結(jié)論證明表達(dá)的重組蛋白具有良好的免疫原性。關(guān)鍵詞：牛傳染性鼻氣管炎病毒；牛；gD蛋白；原核表達(dá)牛傳染性鼻氣管炎fIBRl是由牛傳染性鼻氣管炎病毒fIBRvl又名牛皰疹病毒I型、壞死性鼻炎病毒、傳染性膿皰外陰一陰道炎病毒引起牛的一種急性、熱性、接觸性傳染?。愿邿帷⒑粑щy、鼻炎、鼻竇炎和上呼吸道炎癥為主要特征．還引起母牛流產(chǎn)和死胎、腸炎及小牛腦炎，有時(shí)發(fā)

3、生結(jié)膜炎和角膜炎。本病的病原體是牛傳染性鼻氣管炎病毒．又稱牛皰疹病毒1型．屬于皰疹病毒．n皰疹病毒亞科水痘病毒屬。病毒粒子呈圓形．由162個(gè)殼粒組成正20面體．直徑約130—180nm．由核芯、衣殼和囊膜三種微細(xì)結(jié)構(gòu)組成．50年代在美國(guó)首次發(fā)現(xiàn)本?。壳霸谑澜绶秶鷥?nèi)流行，是造成養(yǎng)牛業(yè)經(jīng)濟(jì)損失的主要原因之一。EuSA等檢測(cè)手段為檢測(cè)IBRv提供了一條靈敏快速的方法．可以及早發(fā)現(xiàn)病毒．防止IBRv在牛群中大量傳播，把經(jīng)濟(jì)損失降到最低點(diǎn)。本試驗(yàn)在大腸桿菌中高效表達(dá)了zD基因部分抗原表位，為IBRvEusA診斷方法的建立打下基礎(chǔ)。1材

4、料和方法★通訊作者1．1質(zhì)粒和菌株表達(dá)載體DET32a由本實(shí)驗(yàn)室保存．DH5Ⅱ、大腸桿菌B12lfDE3)菌株購(gòu)于大連寶生物公司：1．2酶和相關(guān)試劑TaqDNA聚合酶、T4DNA連接酶、dNTP、限制性內(nèi)切酶HindⅢ、BamHI購(gòu)自Taka船公司：DNA快速純化回收試劑盒購(gòu)自上海生物工程公司：IBRv陽(yáng)性血清由本實(shí)驗(yàn)室保存。1．3病毒擴(kuò)增IBRV(bathNu／57株購(gòu)白中國(guó)獸藥監(jiān)察所)接種到MDBK細(xì)胞．培養(yǎng)36—72h后．待70％左右的細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變(cPE)時(shí)，收獲細(xì)胞及上清液．反復(fù)凍融3次．離心后去沉淀．將上清液用

5、于核酸提取。1．4病毒DNA的提取參照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。1．5引物設(shè)計(jì)和合成根據(jù)已發(fā)表的gD基因序列，采用Drimer5．0軟件．設(shè)計(jì)合成如下特異性引物r下劃線部分表示引入的酶切位點(diǎn)、．Pet—l：5’ATGGATCCCTCGGACTGATrA‘『1GGCG3’Pet一2：5’GCAAGCTTTGTA(丑TI'GACG7ITGCCAAAG3-上下游引物擴(kuò)增gD基因目的片段，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為766bp，克隆至DET32a載體．理論上表達(dá)一分子量約53kD、N端帶有His—t《的融合蛋白。1．6目的基因的克隆以提取的核酸為模板．利

6、用設(shè)計(jì)好的引物PCR擴(kuò)增含有HindⅢ、BamHI酶切位點(diǎn)的gD基因。PCR反應(yīng)條件：94℃5min；94℃lmin．55℃lmin．72℃50s．5個(gè)循環(huán)：94屯lmin．65qClmin．72℃50s．共30個(gè)循環(huán)：72℃10min。1％瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR產(chǎn)物。用限制性內(nèi)切酶HindⅢ、BarnHl分別對(duì)目的基因PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體質(zhì)粒DET32a37℃水浴雙酶切．用DNA純化回收試劑盒．純化回收目的DNA片段。將酶切載體與目的片段用T4DNA連接酶連接。轉(zhuǎn)化DH5“感受態(tài)細(xì)胞，利用Amp抗性篩選重組轉(zhuǎn)化體。1．7重

7、組質(zhì)粒的鑒定挑取單個(gè)氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化子，接種含Amp+的LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜．用堿裂解法提取質(zhì)粒。用pet—l和pet一2特異性引物進(jìn)行萬(wàn)方數(shù)據(jù)中囚動(dòng)物檢疫2006年第23卷第7期一28PcR擴(kuò)增．電泳鑒定擴(kuò)增片段：用HindⅢ、BanlHI雙酶切重組質(zhì)粒，電泳檢查插入片段的大小：序列測(cè)定由上海生工完成．1．8基因工程重組表達(dá)菌的誘導(dǎo)表達(dá)及純化將鑒定后的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL2l(DE31感受態(tài)細(xì)胞．接種3mL2×YT(Amp+)培養(yǎng)基．37℃振蕩過(guò)夜后，l：IOO稀釋到2×YT(Anlp+)中，37℃振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期f

8、OD薩0．8)，加入終濃度0．05mmol，L的IPTG．分別于誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后1h、2h、4h、6h收集菌液．用12％聚丙烯酰胺凝膠電泳，觀察結(jié)果。細(xì)菌大量表達(dá)后，純化方法參考脅bondPIlrmcationsvstem試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。純化后的蛋白進(jìn)行SDs—PAGE電泳和