莫諾苷神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制研究

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1、莫諾昔神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制研究王文*、李林、艾厚喜、安易、黃文婷、孫芳林(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院藥物研究室，北京，100053)摘要：目的系統(tǒng)闡述本室從山茱萸提取分離得到的化合物莫諾昔，體外神經(jīng)保護(hù)作用和機(jī)制。方法大孔樹脂分離、硅膠柱層析得到莫諾營，用H2O2損傷神經(jīng)SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)模型研究莫諾甘神經(jīng)保護(hù)作用和機(jī)制。結(jié)果與結(jié)論莫諾甘可能通過抑制細(xì)胞去極化，降低細(xì)胞鈣超載，降低活性氧生產(chǎn)，增加細(xì)胞小分子抗氧化物質(zhì)和抗氧化酶活性減小自由基損傷，從而達(dá)到抑制細(xì)胞凋亡，增加神經(jīng)營養(yǎng)作用這個途徑產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用。關(guān)鍵詞：莫諾甘；神經(jīng)保護(hù)；過氧化氫損傷缺血性腦損傷有高發(fā)病率、高死亡率、

2、高致殘率的特點(diǎn)，嚴(yán)重地威脅著中老年人的身體健康和生活質(zhì)量，隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和社會壓力的增加，發(fā)病年齡逐步降低，給社會和家庭帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。腦缺血引發(fā)腦組織細(xì)胞產(chǎn)生級聯(lián)反應(yīng)，引起腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡和死亡，難以建立有效的信息聯(lián)系，造成患者死亡或者愈后殘疾，因此抑制腦神經(jīng)細(xì)胞凋仁促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞再生是解決問題的關(guān)鍵，也是當(dāng)前國際研究的熱點(diǎn)⑴。人神經(jīng)母細(xì)胞SH-SY5Y細(xì)胞系繁殖快，細(xì)胞形態(tài)、生理和生化功能與止常神經(jīng)細(xì)胞和似，被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)病機(jī)制和紗物作用機(jī)制方面的研究。過氧化氫(H2O2)是一種較強(qiáng)的氧化劑，它產(chǎn)生的輕自由基(-OH)可引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，對SY5Y細(xì)胞

3、有明顯的損傷作用，模擬腦缺血造成的氧化損傷。我們對33味中藥進(jìn)行了神經(jīng)保護(hù)作用篩選，發(fā)現(xiàn)山茱萸壞烯儲菇營對D■半乳糖致腦老化癡呆小鼠模型及光化學(xué)誘導(dǎo)的腦梗塞人鼠模型均具有改善作用，并能提高隔海馬穹隆傘切斷擬Alzheimer病(AD)模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能，明顯減少模型鼠內(nèi)側(cè)隔核區(qū)和海馬齒狀回多形層神經(jīng)元的喪失3】。對山茱萸環(huán)烯瞇話昔進(jìn)一步分離，得到莫諾昔，有抗氧化、抑制神經(jīng)細(xì)胞損傷的作用【“，本實(shí)驗(yàn)繼續(xù)對莫諾昔對H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y氧化損傷的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)理進(jìn)行研究。1化學(xué)研究山茱萸水提取，過大孔樹脂，硅膠柱層析，甲醇重結(jié)晶，得到純化合物，經(jīng)ilMS.,3C

4、-NMR.!H-NMR波普數(shù)據(jù)確定莫諾營的結(jié)構(gòu)，HPLC確定莫諾營的含量大于90%o2莫諾昔神經(jīng)保護(hù)作用及機(jī)制實(shí)驗(yàn)2.1對正常神經(jīng)SY5Y細(xì)胞的作用莫諾甘對SY5Y細(xì)胞的濃度超過10000

5、imol/L時產(chǎn)生細(xì)胞毒，在l-100

6、imol/L濃度范圍內(nèi)均可增加SY5Y細(xì)胞的MTT代謝率，10pmol/L是增加細(xì)胞活性的最適濃度，可以增加SY5Y細(xì)胞的MTT代謝率、細(xì)胞軸突長度、胞體面積和細(xì)胞計(jì)數(shù)。2.2對H2O2損傷神經(jīng)SY5Y細(xì)胞的作用與損傷組相比，莫諾背3個劑量組顯著減少了乳酸脫氫酶的釋放率，降低細(xì)胞膜破損程度。2.3對H2O2損傷神經(jīng)SY5Y細(xì)胞抗氧化作用莫諾甘

7、3個劑量組與損傷組相比，用流式細(xì)胞儀測定結(jié)果顯示減少活性氧的釋放，用試劑盒測定顯著抑制了氧化損傷后一氧化氮(NO)及氧自由基(ROS)產(chǎn)生，提高谷胱廿肽(GSH)和超氧化物歧化酶(SOD)含量。2.4對H2O2損傷神經(jīng)SY5Y細(xì)胞抗凋亡作用3個劑量加藥組與損傷組相比，WesternBlot試驗(yàn)顯示促進(jìn)受損神經(jīng)細(xì)胞凋亡調(diào)控因子Bcl?2的持續(xù)高表達(dá)，抑制Caspase?3與Caspase-9的表達(dá)，用流式細(xì)胞儀測定顯示抑制細(xì)胞凋亡。2.5對H2O2損傷神經(jīng)SY5Y細(xì)胞神經(jīng)營養(yǎng)作用3個劑量的莫諾昔組與損傷組比較，WesternBlot試驗(yàn)顯示提高神經(jīng)生長因子(NGF)及腦

8、源性神經(jīng)營養(yǎng)I大I子(BDNF)的表達(dá)水平。2.6對H2O2損傷神經(jīng)SY5Y細(xì)胞膜電位和鈣離子的影響莫諾背3個劑量組與損傷組相比，顯示升高給藥組細(xì)胞膜電位，降低細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度。3結(jié)論莫諾昔可能通過抑制細(xì)胞去極化，降低細(xì)胞鈣超載，降低活性氧生產(chǎn)，增加細(xì)胞小分子抗氧化物質(zhì)和抗氧化酶活性減小ft由基損傷，從而達(dá)到抑制細(xì)胞凋亡，増加神經(jīng)營養(yǎng)作用這個途徑產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用。本項(xiàng)研究已中請國家發(fā)明專利。REFERENCE[1]王文，黃文婷,艾厚喜，等.小藥誘導(dǎo)腦成體神經(jīng)干細(xì)胞的增殖分化.屮國康復(fù)理論與實(shí)踐,2007,13(1):26-28.[2]陸華寶，李林，安文林,等沖藥SSY

9、-B2對隔海馬穹窿傘切斷致大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的改善作用.屮國康復(fù)理論與實(shí)踐,2003,9(5):286-288.[3]陸華寶，李林，安文林，等.中藥SSY-B2促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后軸突再生的分子機(jī)制?中國康復(fù)理論與實(shí)踐,2003,9(7):410-412.[4]WenWang,WentingHuang,LinLi,etal.MorronisidePreventsPeroxide-inducedApoptosisbyInductionofEndogenousGlutathioneinHumanNeuroblastomaCell.CellMolNeuro