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1、分子診斷學(xué)陳昌杰病因內(nèi)因和外因兩大類內(nèi)因主要指遺傳因素，如基因結(jié)構(gòu)、基因表達(dá)狀況的改變，其中基因結(jié)構(gòu)的改變包括點(diǎn)突變、插入、缺失、重排、易位、基因結(jié)構(gòu)多態(tài)性變異、前病毒插入等；而基因表達(dá)狀況改變則包括轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)或表達(dá)量的異常。外因是指外在的環(huán)境因素，如生活方式、工作環(huán)境、精神狀況和各種感染性病原體的侵入等。第十章感染性疾病的分子診斷分子診斷（moleculardiagnosis）是指通過(guò)檢測(cè)基因的結(jié)構(gòu)異?；蚱浔磉_(dá)異常，對(duì)人體的健康狀態(tài)和疾病作出診斷的方法。評(píng)估基因的存在和缺陷通常以DNA為材料，而評(píng)估基因的表達(dá)量則以基因轉(zhuǎn)錄或翻譯的產(chǎn)物RNA/蛋白質(zhì)分析來(lái)評(píng)估個(gè)體的生理/病理
2、狀態(tài)。分子診斷技術(shù)主要包括核酸雜交聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）基因芯片技術(shù)感染性疾病即由病原微生物引起的疾病的統(tǒng)稱。外源性感染：指由外界致病病原體侵人人體后導(dǎo)致的感染，如傷寒、病毒性肝炎等多為外源性感染。 內(nèi)源性感染：指由人體自身的正常菌群，在人體免疫功能下降時(shí)引起的感染，因?yàn)檫@些細(xì)菌必須在一定條件下才能致病，所以又稱為條件致病菌或機(jī)會(huì)致病菌，如腸道菌群中的大腸埃希菌、腸球菌等引起的感染多為內(nèi)源性感染。分子診斷對(duì)感染性疾病可用于以下幾個(gè)方面：適用不易培養(yǎng)的；種屬鑒定；早期診斷；動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)；流行病學(xué)調(diào)查；基因分型；耐藥檢測(cè)。感染性病原體進(jìn)行分子診斷，取決于兩個(gè)條件：一是在該病原體核酸中有
3、特異的核酸序列（感染性病原體本身含有一些保守序列，即使在不同的基因型這些保守序列的變異也很小，因此可以根據(jù)保守序列設(shè)計(jì)探針或引物）；二是能夠根據(jù)特異的核酸序列設(shè)計(jì)和制備具有特定信號(hào)的探針或設(shè)計(jì)合成相應(yīng)PCR引物，多數(shù)感染性疾病的病原體都具備上述兩個(gè)條件。診斷策略可以分為以下兩種：一般性檢出策略完整檢出策略一般性檢出策略所提供的感染性病原體的信息量較少，幾乎不提供型別（包括變異株）和耐藥性方面的信息，因此，對(duì)于感染感染性疾病分子診斷一般性策略只是快速診斷是何種病原體的感染。為了得到更多的疾病病原體信息，建議應(yīng)該采取完整策略按照診斷→分型→亞型→耐藥性檢測(cè)的思路，利用多種分子診斷手段
4、對(duì)感染性病原體進(jìn)行分析。第一節(jié)病毒的基因檢測(cè)人類許多感染性疾病由病毒引起，如肝炎、腦炎、脊髓灰質(zhì)炎、流行性感冒、狂犬病、艾滋病等。根據(jù)病毒的核酸成分，可將其分為脫氧核糖核酸（DNA）病毒和核糖核酸（RNA）病毒兩大類。一、乙型肝炎病毒乙型肝炎病毒（hepatitisBvirus,HBV）是引起病毒性肝炎的主要病原體之一，屬嗜肝DNA病毒科的原型病毒，病毒毒粒中含內(nèi)源性DNA聚合酶活性。嗜肝病毒科有獨(dú)特的復(fù)制方式，病毒合成以RNA中間體為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成DNA鏈，在某些方面，HBV與逆轉(zhuǎn)錄病毒有許多相似性。乙型肝炎病毒(HBV)感染是一個(gè)嚴(yán)重的全球問(wèn)題,據(jù)估計(jì)全球大約有20億人曾
5、經(jīng)感染乙肝病毒,慢性HBV感染者約315億~4億人,每年有50萬(wàn)~120萬(wàn)人死于HBV感染。我國(guó)是乙型肝炎的高發(fā)區(qū),每年約有10%~20%的急性乙肝將轉(zhuǎn)成慢性肝炎,肝硬化甚至發(fā)展成肝癌,嚴(yán)重威脅著人們的健康,急性乙肝的慢性化及慢性肝炎癌變的發(fā)生機(jī)制是多年來(lái)肝病研究的重點(diǎn)。HBV感染的病原學(xué)診斷免疫血清學(xué)檢測(cè)HBV的血清學(xué)標(biāo)志物分子生物學(xué)方法檢測(cè)免疫學(xué)方法測(cè)定病毒抗體是一種快速簡(jiǎn)便的檢測(cè)手段,常用的方法是間接ELISA,目前我國(guó)HBV檢測(cè)采用的第三代ELISA試劑由多種病毒抗原組合匹配,具有較好的靈敏性和特異性,但其在病毒感染的窗口期不能檢測(cè)到抗體,這在很大程度上限制了ELISA檢
6、測(cè)的準(zhǔn)確性,不能有效的控制病毒的傳播,因而,發(fā)展新的診斷HBV感染主要依賴分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)病毒DNA的檢測(cè)。（一）病毒基因組結(jié)構(gòu)HBV是一種可感染人體、且具有獨(dú)立復(fù)制能力的雙鏈DNA病毒，具有以下幾個(gè)特點(diǎn)：①不完全雙鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)；②利用重疊的開(kāi)放讀碼框架(ORF)可編碼多個(gè)蛋白質(zhì)；③所有調(diào)控序列均位于蛋白質(zhì)編碼區(qū)；④基因序列具有多變性。HBV基因組是已知可感染人類又能獨(dú)立進(jìn)行復(fù)制的雙鏈DNA病毒中最小和最高效的。HBV基因組具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，是一個(gè)長(zhǎng)約3.2kb的不完全雙鏈環(huán)狀DNA。雙鏈的長(zhǎng)度不對(duì)稱，長(zhǎng)鏈(L)因與病毒mRNA互補(bǔ)，定為負(fù)鏈；短鏈(S)為正鏈，5’末端固定，3’末端
7、位置不固定，S正鏈的長(zhǎng)度可為L(zhǎng)負(fù)鏈的50~100%，因而在病毒群體中出現(xiàn)不同長(zhǎng)度的正鏈與全長(zhǎng)的負(fù)鏈匹配，故僅有部分基因組長(zhǎng)度為雙鏈。HBV基因組L鏈上至少有4個(gè)ORF，分別稱為S、C、P和X，編碼外膜蛋白、核殼蛋白、聚合酶和X蛋白。多個(gè)ORF重疊的結(jié)果使HBV本身3.2kb基因組序列的利用率高達(dá)150~200%。（二）分子診斷方法1．PCR2.支鏈DNA技術(shù)3.核酸雜交4.基因芯片技術(shù)逆向斑點(diǎn)雜交法原理就是將各種探針固定在基質(zhì)上,用以檢測(cè)受檢的各種標(biāo)記樣品中與探針互補(bǔ)的核酸物質(zhì)的
